由于光學檢測具有高的時空分辨率、高靈敏度和安全的非電離輻射，人們為開發用于傳感應用的光學納米顆粒付出了巨大的努力。光學納米顆粒具有信號放大和多重檢測的能力，在體外診斷中具有獨特的地位。光學納米顆粒是很有前途的診斷工具; 然而，它們較淺的光學成像深度和較慢的清除速度阻礙了它們用于體內疾病檢測。

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2022年4月14日，浦侃裔課題組在NATURE MATERIALS上發表了題為Renal clearable polyfluorophore nanosensors for early diagnosis of cancer and allograft rejection的研究成果。

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該課題組開發了活化多熒光基團納米傳感粒子，此傳感粒子可以通過生物標志物激活納米粒子到分子的轉換，并且具有對近紅外熒光反饋的能力。此傳感器可以在疾病發生區域積累，并與疾病相關的蛋白酶進行反應，促進原位酶催化解聚。這種疾病特異性的相互作用可以激活多氟載體納米傳感器中可腎臟代謝的熒光片段，用于無創縱向尿液分析，并優于血液和尿液分析黃金標準，其敏感性和特異性水平可與有創活檢和流式分析相媲美。此研究成果有望通過簡單的尿液測試應用于一系列疾病的早期診斷。

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該研究中報道了可激活的多熒光團納米傳感器(APNs)的開發，具有生物標志物觸發的腎臟清除和熒光反應，用于無創近紅外熒光(NIRF)在體內成像和尿液分析。APN是通過烷基鏈上疊氮基團的熒光團(NH2CyOH)和苯胺基團級聯的自燃連接劑(4-氨苯基共軛苯炔二甲醇)縮聚而成的。自滅接合體的苯胺基團被二肽acetyl-Phe–Lys (Ac-FK)或四肽acetyl-Ile–Glu–Phe–Asp (Ac-IEFD)固定，Ac-FK和Ac-IEFD別是CatB27和GzmB28的特定底物。這些肽偶聯的自滅性單體分別與NH2CyOH聚合形成聚合物C和聚合物G，聚合物C/G側鏈上的疊氮基進一步與炔基化hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD)或炔基化 cyclic arginine–glycine–aspartate motif (cRGDfK)通過鏈接反應分別生成APNC和APNG。

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圖1 各APN的蛋白酶反應肽刷(肽序列:Ac-FK和Ac-IEFD)、腎臟代謝部分(HPβCD)和靶向部分(cRGD)的化學結構

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在激活狀態下，蛋白酶切割肽刷，誘導級聯自消除解聚APN主干，釋放可代謝的熒光基團片段，用于NIRF成像和尿液分析。兩種蛋白酶， cathepsin B (CatB)和 granzyme B (GzmB)，分別與腫瘤進展和異體移植排斥反應中的淋巴細胞激活相關，被選擇作為構建APN的生物標志物。

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圖2 納米粒子到分子的藥代動力學轉換和APN用于成像和尿液分析的熒光開啟的分子機制

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該項研究中使用的 GzmB (C765, Novoprotein) 來自近岸蛋白，同時，近岸蛋白還提供系列工具酶及重組蛋白等。

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癌癥的早期診斷對治療和提高生存率至關重要。然而，由于現有方法的靈敏度和特異性較低，對于檢測超小腫瘤(<2mm)仍然具有挑戰性。該研究在原位肝腫瘤模型中進一步評估了APNC對腫瘤實時成像和尿液分析的可行性，注射APNC后通過測定尿CyCD檢測瘤內CatB水平。在腫瘤植入后的3、8和14天，這些信號分別比對照組小鼠增加了1.8倍、3.8倍和7.8倍。 尿液中活化的APNC百分比與腫瘤大小密切相關?；贏PNC的尿液分析可以檢測到直徑小于1.9毫米的原位肝腫瘤。

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圖3 APNC在活體小鼠原位肝腫瘤成像和尿液分析中的作用機制示意圖

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圖4 不同組小鼠注射APNC后尿液中活化APNC的NIRF強度

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圖5 線性回歸分析研究尿液中活化的APNC百分比與腫瘤大小的相關性

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實時監測活化T淋巴細胞的存在對診斷免疫介導的疾病和實體器官異體移植排斥至關重要。在concanavalin A (con-A)誘導的小鼠急性免疫介導型肝炎模型上觀察APNG對活化T淋巴細胞的監測能力。治療后5h(5.5倍)首次觀察到NIRF增強;8h后繼續升高(7.3倍)，12h后下降(5.0倍)。

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圖6 con-A誘導的急性免疫介導型肝炎APNG感應機制示意圖

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圖7 Con-A 處理2、5、8或12小時后注射APNG的活鼠和尿液樣本的NIRF圖像

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原位肝移植是終末期肝病患者的選擇，然而異體移植排斥反應仍然是移植后的主要并發癥。有創活檢是診斷異體移植排斥反應和監測免疫抑制藥物治療療效的常規標準。然而，此手術可引起繼發性損傷，僅提供靜態和局灶性病理狀態。因此該研究用大鼠急性肝移植排斥反應模型來評估APNG的檢測效果是否更加有效。

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以健康小鼠移植前尿液信號為基線，在移植后3 d(3.2倍)首次觀察到NIRF對尿CyCD的增強(圖6b)，在移植后4 d和6 d分別增加到4.9倍和3.9倍(圖6b)。Tac治療后，低劑量時信號下降到1.8倍，高劑量時甚至回落到基線水平。

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圖8 肝移植手術過程示意圖，肝異體移植排斥反應機制，移植肝中活化的APNG用于活體大鼠光學尿檢

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圖9 注射APNG后8 h，各組大鼠尿中CyCD排出量的NIRF強度

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基于APNC的縱向尿液分析能夠超靈敏地檢測直徑小于~1.6mm(皮下結直腸癌)和~1.9mm(原位肝癌)的小腫瘤。該技術的靈敏度要比許多臨床成像技術更高。此外，APNC的敏感性等同或高于現有的的無機納米傳感器，在肺腺癌小鼠模型中，腫瘤的LOD下降到~1.8mm。鑒于腫瘤小于5mm時，癌癥治療達到全身治愈的可能性很大，APNC可能成為一種理想的早期癌癥診斷尿液測試技術手段。

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在可激活的多熒光團納米傳感器(APNs)模型中，基于APNG的尿液分析被證明與流式細胞術和活檢一樣敏感，但具有無創和動態的優勢。T細胞浸潤的檢測早于超聲檢查和肝膽顯像，臨床檢測(AST、ALT、ALP)和組織學檢測。另外，基于APNG的尿液分析將急性異體移植排斥反應與創傷和局部炎癥區分開來，這是血液檢查所不能做到的。因此，該研究不僅提供了將光學納米顆粒轉化為體內傳感粒子的新機會，而且創造了一個通用的納米平臺，填補了超敏尿液測試技術應用于早期疾病診斷的空白。

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