期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE

影響因子：17.1

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導語

中、大彈性動脈的自身免疫性血管炎可導致失明、中風、主動脈弓綜合征和主動脈瘤。該疾病通常難以接受免疫抑制治療，并主動脈炎的形式持續進展。然而血管壁中的肉芽型的炎癥浸潤是如何被維持的，以及組織浸潤的T細胞和巨噬細胞是如何被補充的，目前尚不清楚。本研究中利用血管動脈中免疫細胞群的單細胞轉錄組學測序確定了一個具有干細胞樣特征的CD4+ T細胞群。CD4+ T細胞提供組織浸潤和組織損傷效應T細胞存活在三級淋巴結構（TLS）外膜血管，表達轉錄因子T細胞因子1（TCF1），并產生兩個效應群體，EOMES+T細胞和BCL6+ T濾泡輔助細胞。在連續移植實驗中，表達白細胞介素7受體（IL-7R）的TCF1^hiCD4+ T細胞持續發生血管炎。因此，TCF1^hi?CD4+ T細胞作為疾病干細胞，促進自身免疫性組織炎癥的慢性和自主性進展，所以治療將需要靶向干細胞樣CD4+ T細胞，而不是僅僅針對效應T細胞。

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技術服務

單細胞轉錄組學測序、單細胞TCR免疫組庫測序、RNA-seq

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研究內容

1. 大血管炎中的三級淋巴結構

主動脈炎樣本均顯示外膜微血管周圍有密集的單核細胞聚集（圖1A），該表型僅局限于主動脈伴血管炎，且僅在疾病對照組和主動脈炎組中存在（圖1B）。單核聚集物的免疫熒光成像可識別出T細胞和B細胞（圖1C)，主動脈由三個不同的區域組成：T細胞區、B細胞區和T/B混合區。B細胞區通過CD21+濾泡樹突狀細胞（DC）網絡被識別，其中一些包含干細胞中心(圖1C和1D）。大多數的主動脈TLS主要由T細胞和B細胞組成，但約25%主要包含T細胞(圖1D、E和F)。大多數TLS處于晚期成熟階段，有不同的T或B細胞區域（圖1E），淋巴結的結構。TLS形成于血管外膜，很少在間質中出現(圖1G至I)，且主要含有CD4+ T細胞（圖1F）。主動脈TLS富含CD11c+樹突狀細胞（圖1G）。T細胞與抗原呈遞的HLA-DR+細胞有密切的接觸（圖1H）。對TLS駐留細胞的分析顯示，足蛋白+淋巴管通過IL-7的產生促進T細胞的存活（圖1I），主動脈TLS的一個顯著特征是高密度微血管的存在（圖1J），在T細胞區域明顯（圖1K）。小動脈和小靜脈都可以作為TLS引導血管，其中許多表達外周淋巴PNAd蛋白（圖1L），這是內皮小靜脈（HEV）的標志物。PNAd+內皮細胞包裹著滲出的T細胞團塊，緊挨著排列在血管壁平滑肌細胞層之間的T細胞（圖1M-P）。TLS作為內皮下淋巴細胞的延伸區域，EC形成和T細胞聚集是主動脈壁TLS發生過程中的早期原因。

圖1

2. 炎癥狀態下的主動脈壁表達TLS轉錄組特征

為了表征與主動脈自身免疫相關的免疫反應，對42個主動脈瘤樣本進行了全組織RNA測序（RNA-seq）分析。無監督主成分分析（PCA）顯示，主動脈炎組與疾病對照組明顯分離（圖2A)。兩組間共有1070個基因存在差異表達（P值為<0.05）(圖2B）。差異表達基因功能富集（DEGs）顯示了主動脈炎中適應性免疫激活通路的富集（圖2C）。分層聚類提供了主動脈炎組與疾病對照組和正常主動脈組織的基因差異（圖2D）。主動脈炎的病例包括GCA患者，對照組動脈瘤是由動脈粥樣硬化或遺傳性主動脈病變引起。潛在的疾病過程并不影響22個TLS相關基因轉錄本的表達模式（圖2E）。CXCL13和CCL19表達上調，而CCL21表達不上調，并與單核細胞聚集物的大小密切相關（圖2F-G）。組織浸潤性CD45+免疫細胞在主動脈炎中高度富集，為了捕獲與結構淋巴濾泡形成相關的細胞元素，我們對大量RNA-seq數據進行了細胞分類分析(圖2H）。這兩種組織來源的細胞都表達了靜息CD4+記憶T細胞和單核細胞的基因模式?；罨腃D4+記憶T細胞和記憶B細胞只見于主動脈炎（圖2H）。值得注意的是主動脈炎中大多數組織浸潤性T細胞處于靜息狀態(圖2I)。

圖2

3. scRNA-seq定義血管源性CD4+ T細胞的多個亞群

為了闡明參與自身免疫性血管炎的CD4+ T細胞的異質性，從未暴露于免疫抑制治療的動脈中分離出組織CD4+ T細胞。再移植到免疫缺陷非肥胖糖尿病小鼠（NOD）嚴重聯合免疫缺陷（SCID）（NSG）小鼠的動脈中誘導血管炎，scRNA-seq轉錄本的聚類產生了5個聚類，5個聚類之間的差異基因表達分析顯示，它們的轉錄組譜存在顯著差異（圖3A-C）?；谝陨辖Y果，將cluster命名為：TCF1^hi?CD4+ T cells (cluster 0)， TFH-like T cells (cluster 1)，cycling (clusters 2 and 4)和 cytotoxic CD4+ T cells (cluster 3)，TCF1^hi?CD4+ T cells 缺乏關于tox驅動的衰竭的轉錄本和細胞毒功能（圖3E）。盡管抑制標志物如TOX、PDCD1和TIGIT高表達（圖3E-F），細胞毒性CD4+ T細胞翻譯了更高數量的TBX21和IFNG，使它們能夠提供效應功能（圖3E-F）。表達foxp3的CD4+調節性T細胞明顯罕見（圖3E）。TCF1^hi?CD4+ T細胞表達TGFB1和SMAD3轉錄本（圖3G），這與轉化生長因子β（TGF-β）信號可以促進T干和組織Trms的發育的觀點一致。在支持方面，TCF1^hi?CD4+ T細胞富集了整合素家族基因且表達LTB，而這對TLS的支持與發育至關重要（圖3H）。

圖3

4. 不同的血管源性CD4+ T細胞亞群共享TCR克隆

為了探索上述CD4+ T細胞亞群之間的潛在譜系關系，使用Monocle3進行了擬時序分析。細胞軌跡從TCF1^hiCD4+ T細胞開始，隨后分為三個分支，其中兩個分支發展為兩個不同的效應細胞群，TFH樣細胞和細胞毒性CD4+ T細胞。第三個分支產生了循環的CD4+ T細胞（圖4A）。單細胞TCR序列（scTCR-seq）分析，并檢測了TCR克隆型在5個不同的T細胞群之間是否共享。超過40%的TRA和TRB均有克隆擴增，并且在所有5個T細胞簇中均存在擴增的克隆型(圖4D-E）。通常，擴增的克隆型在不同的CD4+ T細胞亞群之間是共享的（圖4F）。TCF1^hi?CD4+ T細胞與所有其他CD4+ T細胞簇共享TCR克隆型(圖4G-H）。這些結果支持了CD4+ TCF1^hi?T細胞具有高可塑性和自我更新能力，并可產生分化的效應T細胞。

圖4

5. TCF1的表達與T細胞分化狀態相關

探討TCF7表達和效應分子表達的T細胞在組織病變中是否仍然存在的區別？TCF7在組織來源的CD4+ T細胞中的表達與TBX21、EOMES、IFNG、GZMB等幾種效應分子的表達呈負相關（圖5A）。在PBMCs中，T-box轉錄因子（TBX21）的表達，也被稱為T-bet，通常與效應分化相關，與主動脈炎患者和對照組的CD4+和CD8+ T細胞中的TCF1蛋白表達呈負相關（圖5B-C）。在自身免疫性疾病過程中功能性地表征TCF1^hi和TCF1^lo?CD4+ T細胞，檢測了老年健康成年人（64至83歲）的T細胞亞群中TCF1的表達。在CD4+和CD8+ T細胞中，幼稚和中央記憶T細胞（TCM）通常表達的TCF1蛋白高于效應記憶T細胞（TEM）和效應記憶CD45RA+ T細胞（TEMRA）（圖5D），表明TCF1表達是低分化T細胞的特征，即使在老年人中也是如此。我們探討了TCF1^hi?T細胞對TCR刺激的反應。從老年人中分離出幼稚性和記憶性CD4+ T細胞，用細胞追蹤標記，并刺激其增殖。初始CD4+ T細胞的后代在增殖細胞中保持高的TCF1表達。最終出現了TCF1^lo亞群（圖5E-F）。令人注意的是，患者來源的T細胞傾向于非效應T細胞。與健康對照組相比，患者的非效應CD4+ T細胞（幼稚+傳統細胞）比例較高，TEMs和TEMRAs比例較低（圖5G）。在CD8+ T細胞中也觀察到類似的現象（圖5H）。

圖5

6. TCF1^hi?CD4+ T細胞優先定位于TLS

為了驗證通過組織來源的CD4+ T細胞的scRNA-seq獲得的結果，我們回到主動脈組織，并定位了通過轉錄組學確定的功能T細胞亞群。免疫熒光分析發現了TLS中的TCF1^hi?T細胞(圖6A)。TCF1在T細胞中的表達是可變的，從高信號表達到低信號表達（圖6A）。為了明確T細胞位置與TCF1表達之間的關系，我們測定了TCF1^hi和TCF1^lo?T細胞在三個位置的比例：外膜TLS、外膜非TLS區和內側腔室。超過50%的TLS駐留的T細胞的TCF1強陽性（圖6A-C）。其他區域有80%以上的T細胞為TCF1^lo（圖6A-C）。同樣，TCF7的表達與TLS的大小相關（圖6D）。為了研究當TCF1hi T細胞被放置在TLS時，它們的高增殖潛能是否保持。增殖標志物Ki67的免疫熒光將增殖的CD4+和CD8+ T細胞定位在外膜層(圖6E-H)，TLS(圖6I-J）。細胞毒性CD4+ T細胞，定義為EOMES+ CD4+ T細胞，同時存在于TLS的內外區域（圖6K）。免疫熒光發現了生發中心內的TFH樣細胞（圖6L）。IFNG、IFNGR1和IFNGR2轉錄本在主動脈炎病例中有差異表達，GSEA為疾病病變中持續進行的II型干擾素（IFN）信號通路提供了進一步的證據(圖6M-N)。

圖6

7. TCF1^hi?T細胞在特定的細胞環境中存活

為了進一步表征TCF1^hi?CD4+ T細胞的組織生態位，確定了TCF1^hi?CD4+ T細胞在TLS中的空間分布。TCF1^hi?CD4+ T細胞同時歸巢于T細胞區和T/B混合區（圖7A-D）。在淋巴結中，DC網絡在T細胞-B細胞區邊界特別密集，CD11c+DC的樹突狀細胞定位于T細胞區（圖7E-G）。在TLS中的CD11c+DC形成了廣泛的網絡，為T細胞的存活創造了一個特殊的環境(圖7E-G) 。還觀察到Ki67+ CD11c+樹突狀細胞，表明它們能夠在TLS中增殖（圖7H）。最后，CD11c+樹突狀細胞經常被包裹在內皮細胞周圍，為免疫與內皮兩種細胞類型之間建立細胞網絡（圖7I-J）。

圖7

8.TCF1^hiCD4+ T細胞可作為疾病干細胞發揮致病作用

我們首先鑒定了IL-7受體（IL-7R）作為一種與TCF7高表達相關的可分類的表面標記物（圖8A）。IL-7R的表達僅限于T細胞(圖8B)，高表達TCF1可區分IL-7R+T和IL-7R?T細胞（圖8C）。利用IL-7R作為TCF1^hi?CD4+ T細胞的替代標記物，我們通過耗盡IL-7R+細胞生成表達TCF1^lo的GCA PBMCs。然后，我們通過含IL-7R（IL-7R+）和IL-7R耗盡（IL-7R?）PBMCs的過繼轉移，在人源化NSG小鼠中誘導血管炎（圖8D）。將炎癥動脈內的T細胞從血管外淋巴組織（主要是NSG小鼠的脾臟）中分離出來，我們將炎癥動脈細胞連續移植到“空”小鼠中，而沒有移植其他的人類細胞（圖8D）。監測原發性和繼發性接受者血液和脾臟中的人類T細胞數量（圖8E）。通過組織學評分，評估炎癥的嚴重程度和擴散以及血管損傷的程度，IL-7R+細胞的PBMCs誘導的血管炎嚴重程度明顯加重（P<0.001）（圖8F-G），表明TCF1^hi?T細胞的致病相關性。我們評估了IL- 7R+ TCF1^hi?T細胞對血管重塑的影響，從血管炎誘導的免疫細胞群中去除IL-7R+細胞顯著降低了VEGFA轉錄，并減少了移植物新血管生成（圖8H-J）。IL-7R+ T細胞群誘導的動脈炎癥富含T細胞，包括高增殖率（Ki67+）T細胞（圖8K-L）。IL-7R+細胞的消耗導致低級別壁炎癥，缺乏兩種主要效應分子IFNG和GZMB的轉錄本（圖8M）?？傊?，這些數據表明，TCF1^hiCD4+ T細胞誘導可轉移性和持續性血管炎，并將其指定為疾病干細胞。

圖8

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參考文獻：

[1]Sato et al. Stem-like CD4+ T cells in perivascular tertiary lymphoid structures sustain autoimmune vasculitis[J]. Sci? Transl? Med， 2023，9.6:15，eadh0380.