期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
影響因子：17.1
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導(dǎo)語
中、大彈性動(dòng)脈的自身免疫性血管炎可導(dǎo)致失明、中風(fēng)、主動(dòng)脈弓綜合征和主動(dòng)脈瘤。該疾病通常難以接受免疫抑制治療，并主動(dòng)脈炎的形式持續(xù)進(jìn)展。然而血管壁中的肉芽型的炎癥浸潤是如何被維持的，以及組織浸潤的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是如何被補(bǔ)充的，目前尚不清楚。本研究中利用血管動(dòng)脈中免疫細(xì)胞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序確定了一個(gè)具有干細(xì)胞樣特征的CD4+ T細(xì)胞群。CD4+ T細(xì)胞提供組織浸潤和組織損傷效應(yīng)T細(xì)胞存活在三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）外膜血管，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1（TCF1），并產(chǎn)生兩個(gè)效應(yīng)群體，EOMES+T細(xì)胞和BCL6+ T濾泡輔助細(xì)胞。在連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)白細(xì)胞介素7受體（IL-7R）的TCF1hiCD4+ T細(xì)胞持續(xù)發(fā)生血管炎。因此，TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞作為疾病干細(xì)胞，促進(jìn)自身免疫性組織炎癥的慢性和自主性進(jìn)展，所以治療將需要靶向干細(xì)胞樣CD4+ T細(xì)胞，而不是僅僅針對效應(yīng)T細(xì)胞。
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技術(shù)服務(wù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序、單細(xì)胞TCR免疫組庫測序、RNA-seq
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研究內(nèi)容
1. 大血管炎中的三級淋巴結(jié)構(gòu)
主動(dòng)脈炎樣本均顯示外膜微血管周圍有密集的單核細(xì)胞聚集（圖1A），該表型僅局限于主動(dòng)脈伴血管炎，且僅在疾病對照組和主動(dòng)脈炎組中存在（圖1B）。單核聚集物的免疫熒光成像可識別出T細(xì)胞和B細(xì)胞（圖1C)，主動(dòng)脈由三個(gè)不同的區(qū)域組成：T細(xì)胞區(qū)、B細(xì)胞區(qū)和T/B混合區(qū)。B細(xì)胞區(qū)通過CD21+濾泡樹突狀細(xì)胞（DC）網(wǎng)絡(luò)被識別，其中一些包含干細(xì)胞中心(圖1C和1D）。大多數(shù)的主動(dòng)脈TLS主要由T細(xì)胞和B細(xì)胞組成，但約25%主要包含T細(xì)胞(圖1D、E和F)。大多數(shù)TLS處于晚期成熟階段，有不同的T或B細(xì)胞區(qū)域（圖1E），淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)。TLS形成于血管外膜，很少在間質(zhì)中出現(xiàn)(圖1G至I)，且主要含有CD4+ T細(xì)胞（圖1F）。主動(dòng)脈TLS富含CD11c+樹突狀細(xì)胞（圖1G）。T細(xì)胞與抗原呈遞的HLA-DR+細(xì)胞有密切的接觸（圖1H）。對TLS駐留細(xì)胞的分析顯示，足蛋白+淋巴管通過IL-7的產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞的存活（圖1I），主動(dòng)脈TLS的一個(gè)顯著特征是高密度微血管的存在（圖1J），在T細(xì)胞區(qū)域明顯（圖1K）。小動(dòng)脈和小靜脈都可以作為TLS引導(dǎo)血管，其中許多表達(dá)外周淋巴PNAd蛋白（圖1L），這是內(nèi)皮小靜脈（HEV）的標(biāo)志物。PNAd+內(nèi)皮細(xì)胞包裹著滲出的T細(xì)胞團(tuán)塊，緊挨著排列在血管壁平滑肌細(xì)胞層之間的T細(xì)胞（圖1M-P）。TLS作為內(nèi)皮下淋巴細(xì)胞的延伸區(qū)域，EC形成和T細(xì)胞聚集是主動(dòng)脈壁TLS發(fā)生過程中的早期原因。
圖1
2. 炎癥狀態(tài)下的主動(dòng)脈壁表達(dá)TLS轉(zhuǎn)錄組特征
為了表征與主動(dòng)脈自身免疫相關(guān)的免疫反應(yīng)，對42個(gè)主動(dòng)脈瘤樣本進(jìn)行了全組織RNA測序（RNA-seq）分析。無監(jiān)督主成分分析（PCA）顯示，主動(dòng)脈炎組與疾病對照組明顯分離（圖2A)。兩組間共有1070個(gè)基因存在差異表達(dá)（P值為<0.05）(圖2B）。差異表達(dá)基因功能富集（DEGs）顯示了主動(dòng)脈炎中適應(yīng)性免疫激活通路的富集（圖2C）。分層聚類提供了主動(dòng)脈炎組與疾病對照組和正常主動(dòng)脈組織的基因差異（圖2D）。主動(dòng)脈炎的病例包括GCA患者，對照組動(dòng)脈瘤是由動(dòng)脈粥樣硬化或遺傳性主動(dòng)脈病變引起。潛在的疾病過程并不影響22個(gè)TLS相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)模式（圖2E）。CXCL13和CCL19表達(dá)上調(diào)，而CCL21表達(dá)不上調(diào)，并與單核細(xì)胞聚集物的大小密切相關(guān)（圖2F-G）。組織浸潤性CD45+免疫細(xì)胞在主動(dòng)脈炎中高度富集，為了捕獲與結(jié)構(gòu)淋巴濾泡形成相關(guān)的細(xì)胞元素，我們對大量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)胞分類分析(圖2H）。這兩種組織來源的細(xì)胞都表達(dá)了靜息CD4+記憶T細(xì)胞和單核細(xì)胞的基因模式。活化的CD4+記憶T細(xì)胞和記憶B細(xì)胞只見于主動(dòng)脈炎（圖2H）。值得注意的是主動(dòng)脈炎中大多數(shù)組織浸潤性T細(xì)胞處于靜息狀態(tài)(圖2I)。
圖2
3. scRNA-seq定義血管源性CD4+ T細(xì)胞的多個(gè)亞群
為了闡明參與自身免疫性血管炎的CD4+ T細(xì)胞的異質(zhì)性，從未暴露于免疫抑制治療的動(dòng)脈中分離出組織CD4+ T細(xì)胞。再移植到免疫缺陷非肥胖糖尿病小鼠（NOD）嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）（NSG）小鼠的動(dòng)脈中誘導(dǎo)血管炎，scRNA-seq轉(zhuǎn)錄本的聚類產(chǎn)生了5個(gè)聚類，5個(gè)聚類之間的差異基因表達(dá)分析顯示，它們的轉(zhuǎn)錄組譜存在顯著差異（圖3A-C）。基于以上結(jié)果，將cluster命名為：TCF1hi?CD4+ T cells (cluster 0)， TFH-like T cells (cluster 1)，cycling (clusters 2 and 4)和 cytotoxic CD4+ T cells (cluster 3)，TCF1hi?CD4+ T cells 缺乏關(guān)于tox驅(qū)動(dòng)的衰竭的轉(zhuǎn)錄本和細(xì)胞毒功能（圖3E）。盡管抑制標(biāo)志物如TOX、PDCD1和TIGIT高表達(dá)（圖3E-F），細(xì)胞毒性CD4+ T細(xì)胞翻譯了更高數(shù)量的TBX21和IFNG，使它們能夠提供效應(yīng)功能（圖3E-F）。表達(dá)foxp3的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯罕見（圖3E）。TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TGFB1和SMAD3轉(zhuǎn)錄本（圖3G），這與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號可以促進(jìn)T干和組織Trms的發(fā)育的觀點(diǎn)一致。在支持方面，TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞富集了整合素家族基因且表達(dá)LTB，而這對TLS的支持與發(fā)育至關(guān)重要（圖3H）。
圖3
4. 不同的血管源性CD4+ T細(xì)胞亞群共享TCR克隆
為了探索上述CD4+ T細(xì)胞亞群之間的潛在譜系關(guān)系，使用Monocle3進(jìn)行了擬時(shí)序分析。細(xì)胞軌跡從TCF1hiCD4+ T細(xì)胞開始，隨后分為三個(gè)分支，其中兩個(gè)分支發(fā)展為兩個(gè)不同的效應(yīng)細(xì)胞群，TFH樣細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD4+ T細(xì)胞。第三個(gè)分支產(chǎn)生了循環(huán)的CD4+ T細(xì)胞（圖4A）。單細(xì)胞TCR序列（scTCR-seq）分析，并檢測了TCR克隆型在5個(gè)不同的T細(xì)胞群之間是否共享。超過40%的TRA和TRB均有克隆擴(kuò)增，并且在所有5個(gè)T細(xì)胞簇中均存在擴(kuò)增的克隆型(圖4D-E）。通常，擴(kuò)增的克隆型在不同的CD4+ T細(xì)胞亞群之間是共享的（圖4F）。TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞與所有其他CD4+ T細(xì)胞簇共享TCR克隆型(圖4G-H）。這些結(jié)果支持了CD4+ TCF1hi?T細(xì)胞具有高可塑性和自我更新能力，并可產(chǎn)生分化的效應(yīng)T細(xì)胞。
圖4
5. TCF1的表達(dá)與T細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)
探討TCF7表達(dá)和效應(yīng)分子表達(dá)的T細(xì)胞在組織病變中是否仍然存在的區(qū)別？TCF7在組織來源的CD4+ T細(xì)胞中的表達(dá)與TBX21、EOMES、IFNG、GZMB等幾種效應(yīng)分子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。在PBMCs中，T-box轉(zhuǎn)錄因子（TBX21）的表達(dá)，也被稱為T-bet，通常與效應(yīng)分化相關(guān)，與主動(dòng)脈炎患者和對照組的CD4+和CD8+ T細(xì)胞中的TCF1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖5B-C）。在自身免疫性疾病過程中功能性地表征TCF1hi和TCF1lo?CD4+ T細(xì)胞，檢測了老年健康成年人（64至83歲）的T細(xì)胞亞群中TCF1的表達(dá)。在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中，幼稚和中央記憶T細(xì)胞（TCM）通常表達(dá)的TCF1蛋白高于效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）和效應(yīng)記憶CD45RA+ T細(xì)胞（TEMRA）（圖5D），表明TCF1表達(dá)是低分化T細(xì)胞的特征，即使在老年人中也是如此。我們探討了TCF1hi?T細(xì)胞對TCR刺激的反應(yīng)。從老年人中分離出幼稚性和記憶性CD4+ T細(xì)胞，用細(xì)胞追蹤標(biāo)記，并刺激其增殖。初始CD4+ T細(xì)胞的后代在增殖細(xì)胞中保持高的TCF1表達(dá)。最終出現(xiàn)了TCF1lo亞群（圖5E-F）。令人注意的是，患者來源的T細(xì)胞傾向于非效應(yīng)T細(xì)胞。與健康對照組相比，患者的非效應(yīng)CD4+ T細(xì)胞（幼稚+傳統(tǒng)細(xì)胞）比例較高，TEMs和TEMRAs比例較低（圖5G）。在CD8+ T細(xì)胞中也觀察到類似的現(xiàn)象（圖5H）。
圖5
6. TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞優(yōu)先定位于TLS
為了驗(yàn)證通過組織來源的CD4+ T細(xì)胞的scRNA-seq獲得的結(jié)果，我們回到主動(dòng)脈組織，并定位了通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的功能T細(xì)胞亞群。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)了TLS中的TCF1hi?T細(xì)胞(圖6A)。TCF1在T細(xì)胞中的表達(dá)是可變的，從高信號表達(dá)到低信號表達(dá)（圖6A）。為了明確T細(xì)胞位置與TCF1表達(dá)之間的關(guān)系，我們測定了TCF1hi和TCF1lo?T細(xì)胞在三個(gè)位置的比例：外膜TLS、外膜非TLS區(qū)和內(nèi)側(cè)腔室。超過50%的TLS駐留的T細(xì)胞的TCF1強(qiáng)陽性（圖6A-C）。其他區(qū)域有80%以上的T細(xì)胞為TCF1lo（圖6A-C）。同樣，TCF7的表達(dá)與TLS的大小相關(guān)（圖6D）。為了研究當(dāng)TCF1hi T細(xì)胞被放置在TLS時(shí)，它們的高增殖潛能是否保持。增殖標(biāo)志物Ki67的免疫熒光將增殖的CD4+和CD8+ T細(xì)胞定位在外膜層(圖6E-H)，TLS(圖6I-J）。細(xì)胞毒性CD4+ T細(xì)胞，定義為EOMES+ CD4+ T細(xì)胞，同時(shí)存在于TLS的內(nèi)外區(qū)域（圖6K）。免疫熒光發(fā)現(xiàn)了生發(fā)中心內(nèi)的TFH樣細(xì)胞（圖6L）。IFNG、IFNGR1和IFNGR2轉(zhuǎn)錄本在主動(dòng)脈炎病例中有差異表達(dá)，GSEA為疾病病變中持續(xù)進(jìn)行的II型干擾素（IFN）信號通路提供了進(jìn)一步的證據(jù)(圖6M-N)。
圖6
7. TCF1hi?T細(xì)胞在特定的細(xì)胞環(huán)境中存活
為了進(jìn)一步表征TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞的組織生態(tài)位，確定了TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞在TLS中的空間分布。TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞同時(shí)歸巢于T細(xì)胞區(qū)和T/B混合區(qū)（圖7A-D）。在淋巴結(jié)中，DC網(wǎng)絡(luò)在T細(xì)胞-B細(xì)胞區(qū)邊界特別密集，CD11c+DC的樹突狀細(xì)胞定位于T細(xì)胞區(qū)（圖7E-G）。在TLS中的CD11c+DC形成了廣泛的網(wǎng)絡(luò)，為T細(xì)胞的存活創(chuàng)造了一個(gè)特殊的環(huán)境(圖7E-G) 。還觀察到Ki67+ CD11c+樹突狀細(xì)胞，表明它們能夠在TLS中增殖（圖7H）。最后，CD11c+樹突狀細(xì)胞經(jīng)常被包裹在內(nèi)皮細(xì)胞周圍，為免疫與內(nèi)皮兩種細(xì)胞類型之間建立細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖7I-J）。
圖7
8.TCF1hiCD4+ T細(xì)胞可作為疾病干細(xì)胞發(fā)揮致病作用
我們首先鑒定了IL-7受體（IL-7R）作為一種與TCF7高表達(dá)相關(guān)的可分類的表面標(biāo)記物（圖8A）。IL-7R的表達(dá)僅限于T細(xì)胞(圖8B)，高表達(dá)TCF1可區(qū)分IL-7R+T和IL-7R?T細(xì)胞（圖8C）。利用IL-7R作為TCF1hi?CD4+ T細(xì)胞的替代標(biāo)記物，我們通過耗盡IL-7R+細(xì)胞生成表達(dá)TCF1lo的GCA PBMCs。然后，我們通過含IL-7R（IL-7R+）和IL-7R耗盡（IL-7R?）PBMCs的過繼轉(zhuǎn)移，在人源化NSG小鼠中誘導(dǎo)血管炎（圖8D）。將炎癥動(dòng)脈內(nèi)的T細(xì)胞從血管外淋巴組織（主要是NSG小鼠的脾臟）中分離出來，我們將炎癥動(dòng)脈細(xì)胞連續(xù)移植到“空”小鼠中，而沒有移植其他的人類細(xì)胞（圖8D）。監(jiān)測原發(fā)性和繼發(fā)性接受者血液和脾臟中的人類T細(xì)胞數(shù)量（圖8E）。通過組織學(xué)評分，評估炎癥的嚴(yán)重程度和擴(kuò)散以及血管損傷的程度，IL-7R+細(xì)胞的PBMCs誘導(dǎo)的血管炎嚴(yán)重程度明顯加重（P<0.001）（圖8F-G），表明TCF1hi?T細(xì)胞的致病相關(guān)性。我們評估了IL- 7R+ TCF1hi?T細(xì)胞對血管重塑的影響，從血管炎誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞群中去除IL-7R+細(xì)胞顯著降低了VEGFA轉(zhuǎn)錄，并減少了移植物新血管生成（圖8H-J）。IL-7R+ T細(xì)胞群誘導(dǎo)的動(dòng)脈炎癥富含T細(xì)胞，包括高增殖率（Ki67+）T細(xì)胞（圖8K-L）。IL-7R+細(xì)胞的消耗導(dǎo)致低級別壁炎癥，缺乏兩種主要效應(yīng)分子IFNG和GZMB的轉(zhuǎn)錄本（圖8M）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，TCF1hiCD4+ T細(xì)胞誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)移性和持續(xù)性血管炎，并將其指定為疾病干細(xì)胞。
圖8
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參考文獻(xiàn)：
[1]Sato et al. Stem-like CD4+ T cells in perivascular tertiary lymphoid structures sustain autoimmune vasculitis[J]. Sci? Transl? Med， 2023，9.6:15，eadh0380.