?
卵巢癌（Ovarian Cancer）是最具破壞性的婦科癌癥，目前5年總生存率低至47%【1】。卵巢癌是一種高度異質性疾病，通常根據組織病理學、分子生物學和遺傳學分析的結果，將卵巢癌分為兩大類：I型卵巢癌病情進展緩慢，主要為低級別漿液性癌（LGSC），粘液癌，子宮內膜樣癌，透明細胞癌等；II型癌癥則進展迅速，主要為高級別漿液性癌（HGSC）、未分化癌和癌細胞瘤。
?
?
治療卵巢癌的標準方式是手術切除和鉑-紫杉醇化療相結合，然而這類化療方式往往對于透明細胞癌和粘液癌患者無效【2,3】；此外，初始化療后通常會由于鉑類耐藥而復發，因此建立更精準的卵巢癌模型對于深入理解疾病機理和個性化治療是必不可少的。基于類器官技術的OC類器官就是可以模擬來源組織關鍵特征的體外模型，不僅能夠再現患者體內腫瘤的特異性（包括表型特性和基因突變），并能夠檢測患者對藥物的敏感性。
?
?
本篇文章基于STAR Protocols【4】發表的文章，整理了病人組織來源的卵巢癌類器官的培養方案。
?
?
?
圖1. 病人組織來源的卵巢癌類器官培養方案【5】
?
?
細胞來源
?
活檢樣本或手術樣本
?
?
培養基配方
?
?
?
組織處理
?
?
1. 將取樣培養基中的組織轉移到培養皿中，用PBS多次沖洗至液體變澄清。然后用無菌手術刀剔除脂肪及壞死組織。
?
?
2. 將組織切割為1–2 mm3的小塊，此步驟可以留存適量組織用于測序、免疫組化分析等。
?
?
3. 將所有剩余的組織碎片收集到30 ml錐形管中，加入8 ml解離培養基，并在37°C條件下解離1-2h。每隔20min，利用移液器機械吹打，促進解離。
?
?
4. 向懸浮液中加入50μl脫氧核糖核酸酶（0.2mg / ml），并在20°C-22°C下孵育1min。
?
?
5. 加入8ml 預冷的DMEM/F12（含10%FBS）終止消化。
?
?
6. 將懸浮液經過70μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。
?
?
7. 將過濾的細胞懸液在4℃條件下220g離心5min。
?
?
8. 用1ml DMEM / F12（20°C-22°C）沖洗細胞一次，離心收集細胞沉淀后，加入500μl DMEM / F12（20°C-22°C）重懸細胞，并在細胞計數后，將細胞懸液調整濃度至1,500個細胞/μl。
?
類器官培養
?
?
9. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在冰上以7：3的體積比將Matrigel與細胞懸液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。
?
?
10. 從37℃培養箱中取出預熱的48孔板，將20μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
?
?
11. 將48孔板倒置放入37℃，5%CO2的培養箱中孵育10min，使Matrigel固化。
?
?
12. 向每個孔中緩慢滴加250μl 預熱的OCO (Ovarian Cancer Organoid) 培養基，確?；|膠被完全覆蓋。放于37℃，5%CO2的培養箱中培養，每2-3天更換培養基（用于換液的OCO培養基內不含Y27632)。
?
類器官傳代
?
?
13. 當直徑達到約200-300μm時，將類器官按照1:3-1:5的比例進行傳代（具體比例通過類器官的匯合度確定）
?
?
14. 吸出孔內培養基，加入400μl預冷的DMEM/F12培養基，并用移液器多次吹打，從基質膠中釋放類器官。如果將多個孔合并，則將400μl培養基從第一個孔轉移到下一個孔（依此類推）。
?
?
15. 將收集的類器官轉移到1.5 ml Eppendorf管中并放在冰上，4℃條件下220g離心5min。
?
?
16. 去除離心上清，并添加37℃預熱的TrypLE Express（含10μM Y27632）。輕輕旋轉Eppendorf管，使類器官與TrypLE Express混合均勻。
?
?
17. 37℃條件下將類器官與TrypLE孵育10min（致密型類器官）或5min（低粘性和囊性類器官）。
?
?
18. 加入500μl預冷的DMEM/F12終止消化，4℃條件下220g離心5min。
?
?
19. 將類器官沉淀重懸于700μl預冷的DMEM / F12中，使用移液器吹打數次，機械地破壞類器官。
?
?
20. 將所得細胞懸液重復8-12步驟，完成傳代。
?
類器官凍存
?
?
21. 取1-4個孔的類器官，消化離心后取細胞沉淀，加入1ml細胞凍存液。
?
?
22. 將細胞重懸后轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。
?
?
23. 第二天，將樣品轉移到液氮中長期儲存。
?
類器官復蘇
?
?
24. 將液氮凍存的OC類器官放置在37℃水浴鍋中進行解凍，水浴時間不宜超過2min。
?
?
25. 將細胞懸液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM/F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下220g離心5min，取細胞沉淀。
?
?
26. 將所得細胞重復8-12步驟，完成OC類器官復蘇。
?
?
?
圖2. OC類器官的不同形態表型。即致密（左），囊性（中）和低內聚（右）型OC類器官。比例尺200 μm【4】。
?
?
卵巢癌類器官樣本來源不局限于活檢樣本或手術樣本，腹水和胸腔積液中的癌細胞也同樣可以用于構建OC類器官。培養成功的OC類器官經過DNA修復的功能性分析，可以準確預測患者對DNA修復抑制劑的臨床反應【6】。同時，OC類器官也可以作為藥物篩選的模型，通過分析個體患者來源的OC類器官對化療藥物敏感性的差異，來預測患者對特定藥物的臨床反應，從而選擇針對患者的最佳治療方案【7】。通過構建病人來源的OC類器官，對于更深入地了解卵巢癌的病因、發病機制、異質性和耐藥性至關重要，并且對于確定新的治療靶點和新藥研發、患者用藥決策方面都有著巨大的潛力。
?
?
?
?
近岸蛋白自主研發生產的低內毒素Activin A、FGF系列、HGF、R-Spondin 1、Noggin和Wnt3a等細胞因子，內毒素低至＜10EU/mg，具有高活性、高純度、高批間一致性，為類器官培養設計，已獲得市場認可，讓您研究放心！
?
?
?
推薦產品-卵巢癌類器官
?
?
|
貨號 |
產品名稱 |
|
Human EGF |
|
|
Mouse EGF (C-6His) |
|
|
Human HGF (C-6His) |
|
|
Mouse HGF (C-6His) |
|
|
Human LR3 IGF-I |
|
|
Mouse LR3-IGF-1 (C-6His) |
|
|
Human Noggin |
|
|
Mouse Noggin(C-6His) |
|
|
Human NRG1-beta 1 |
|
|
Human R-Spondin 1 (C-6His) |
?
相關產品：
?
?
|
貨號 |
產品名稱 |
|
Human/Mouse/Rat Activin A |
|
|
Human/Mouse/Rat BDNF |
|
|
Human/Mouse/Rat BMP-2 |
|
|
Human DKK1 (N-8His) |
|
|
Human FGF basic/FGF-2 |
|
|
Mouse FGF basic/FGF-2 |
|
|
Human FGF-4 |
|
|
Mouse FGF-4 |
|
|
Human FGF-7/KGF |
|
|
Human FGF-9 |
|
|
Mouse FGF-9 (N-6His) |
|
|
Human FGF-10 |
|
|
Human FGF-19 (N-6His) |
|
|
Human GDNF |
|
|
Human LIF |
|
|
Mouse LIF |
|
|
Human NT-3 |
|
|
Human OSM (N-6His) |
|
|
Human Prolactin/PRL |
|
|
Human R-spondin 3 (C-6His) |
|
|
Human Shh |
|
|
Human Shh (C24II) |
|
|
Mouse Shh |
|
|
Mouse Shh(C25II) |
|
|
Human TGF-beta 1 |
|
|
Human Wnt3a |
|
|
Human Wnt3a V2 |
?
?
?
歡迎各位掃碼加入類器官培養交流群，在這里會有專業的技術支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！
?
?
?
類器官培養交流群
?
參考文獻
?
【1】Siegel R. L. et al. Cancer statistics, 2016[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2016, 66(1): 7-30.
?
?
【2】Pectasides D. et al. Advanced stage clear-cell epithelial ovarian cancer: the Hellenic Cooperative Oncology Group experience[J]. Gynecologic oncology, 2006, 102(2): 285-291.
?
?
【3】Hess V. et al. Mucinous epithelial ovarian cancer: a separate entity requiring specific treatment[J]. Journal of clinical oncology, 2004, 22(6): 1040-1044.
?
?
【4】Maenhoudt, N., & Vankelecom, H. (2021). Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR protocols, 2(2), 100429.
?
?
【5】Kopper O. et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity[J]. Nature medicine, 2019, 25(5): 838-849.
?
?
【6】Hill S J. et al. Prediction of DNA Repair Inhibitor Response in Short-Term Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids DNA Repair Profiling of HGSC Organoids[J]. Cancer discovery, 2018, 8(11): 1404-1421.
?
?
【7】Liu H D. et al. Organoid of ovarian cancer: genomic analysis and drug screening[J]. Clinical and Translational Oncology, 2020, 22(8): 1240-1251.
蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
詳詢www.novoprotein.com.cn或致電400-600-0940。