由新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠病毒肺炎（COVID-19）是一種全球流行性傳染病，其刺突蛋白S1/S2邊界的多堿基弗林蛋白酶（Furin）切割位點(diǎn)是SARS-CoV-2的標(biāo)志，在病毒感染中起著至關(guān)重要的作用。然而，F(xiàn)urin活化及其調(diào)控的機(jī)制仍然知之甚少。
2024年5月16日，中山大學(xué)藥學(xué)院毛洋教授、袁燕秋副教授聯(lián)合廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院趙金存教授團(tuán)隊(duì)在“Nature Communications，IF 16.6”在線發(fā)表題為Sequential glycosylations at the multibasic cleavage site of SARS-CoV-2 spike protein regulate viral activity的論文，研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了糖基化作為宿主細(xì)胞對(duì)抗SARS-CoV-2的防御機(jī)制的作用，并揭示了宿主與病毒之間的進(jìn)化相互作用，為開發(fā)針對(duì)SARS-CoV-2的潛在治療干預(yù)策略奠定了理論基礎(chǔ)。
研究結(jié)果
1、GalNAc-T3和T7抑制刺突蛋白的Furin加工
首先，作者分析了新冠病毒刺突蛋白的O-糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)T678、S686和S689可能是Furin酶附近的潛在糖基化位點(diǎn)，進(jìn)一步通過體外糖基化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶GalNAc-T3與T7活性可能與重組刺突蛋白上鑒定的O-糖基化位點(diǎn)(T678、S686和S689)有關(guān)。接下來，為確定GalNAc-T3和T7引發(fā)的O-糖基化是否能抑制細(xì)胞中S蛋白多堿基切割位點(diǎn)的蛋白酶加工，作者構(gòu)建了一個(gè)包含刺突多堿基切割位點(diǎn)蛋白酶加工活性的熒光素酶生物傳感器。結(jié)合體外酶活性測(cè)定，生物傳感器實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GalNAc-T3和T7在SARS-CoV-2 S蛋白多堿基切割位點(diǎn)上的串聯(lián)糖基化修飾能夠抑制細(xì)胞內(nèi)Furin的切割。在合胞體形成測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，T7在S686位點(diǎn)的糖基化在阻止細(xì)胞蛋白酶的蛋白質(zhì)加工和抑制其融合活性方面起著關(guān)鍵作用，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2刺突蛋白的激活具有潛在的意義。
圖1. GalNAc-T3和T7通過在T678和S686位點(diǎn)特異性糖基化抑制Furin對(duì)S蛋白的加工
2、GalNAc-T3和T7抑制Furin依賴的病毒樣顆粒的組裝
由于參與O-糖基化途徑的大多數(shù)酶位于高爾基體中，冠狀病毒在ER-高爾基中間室(ERGIC)中組裝，因此作者探究了GalNAc-T3和T7糖基化活性對(duì)組裝的病毒樣顆粒中刺突蛋白Furin切割的潛在影響。在具有或不具有GALNT3和/或GALNT7 KI的HEK293T細(xì)胞中組裝SARS-CoV-2的病毒樣顆粒(VLPs)，發(fā)現(xiàn)GALNT3和GALNT7的雙KI導(dǎo)致包裝在VLP顆粒中的刺突蛋白數(shù)量減少了大約80%，而刺突蛋白在總細(xì)胞裂解物中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。相比之下，GALNT3的單個(gè)KI或普遍表達(dá)的GALNT1并不顯著影響刺突蛋白在VLP中的組裝，而GALNT7的單個(gè)KI也顯著降低刺突蛋白的結(jié)合量( 53 % )。盡管在細(xì)胞裂解液中存在大量未裂解的刺突蛋白，但整合到VLPs中的刺突蛋白主要被裂解。這一發(fā)現(xiàn)表明裂解的刺突蛋白可以更有效地整合到VLP中，F(xiàn)urin加工有助于刺突蛋白組裝到SARS-CoV-2的VLP中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GalNAc-T3和T7可能通過T678和S686的糖基化抑制刺突蛋白并入VLP。接下來，作者研究了Furin切割依賴的刺突蛋白組裝到SARS CoV-2病毒粒子中的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的M蛋白通過其EE基序與Furin切割時(shí)暴露的S1片段富含精氨酸的C端之間的電荷相互作用與裂解的S蛋白特異性相互作用，這種相互作用對(duì)于含有刺突蛋白的功能性病毒粒子的組裝是必不可少的。綜上，宿主細(xì)胞中表達(dá)的GalNAc-T3和T7對(duì)Furin切割的調(diào)控可能對(duì)病毒粒子組裝產(chǎn)生重大影響，從而影響SARS-CoV-2引起的感染。
圖2. GalNAc-T3和T7抑制Furin依賴的病毒樣顆粒的組裝
3、多堿基切割位點(diǎn)附近的突變改變了GalNAc-T3和T7的糖基化效率
在WHO劃分的5種關(guān)切變異株(VOC)中，有3種在脯氨酸681 (P681)處攜帶突變，距離糖基化位點(diǎn)T678有3個(gè)氨基酸。其中，α和Omicron變體在該位置有一個(gè)組氨酸(P681H)，而δ變體在該位置有一個(gè)精氨酸(P681R)。此外，Omicron變體在O-糖基化位點(diǎn)T678旁邊攜帶N679K突變。作者推測(cè)P681突變可能在體外影響GalNAc-T3和T7對(duì)S蛋白的酶活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將合成肽底物中的P681殘基與組氨酸(P681H)交換時(shí)，GalNAc-T3和T7不能有效地將肽糖基化；當(dāng)P681H突變與發(fā)生在Omicron中的N679K突變疊加時(shí)，GalNAc-T3和T7在酶促實(shí)驗(yàn)中對(duì)合成肽恢復(fù)了顯著的活性，產(chǎn)生了單/雙GalNAc修飾產(chǎn)物。以上結(jié)果表明SARS-CoV-2變異體在多堿基切割位點(diǎn)附近攜帶的突變對(duì)GalNAc-T3和T7的糖基化效率有顯著影響，SARS-CoV-2的早期變體(α和δ)攜帶的P681突變可能使病毒能夠抵抗宿主細(xì)胞糖基化，但在Omicron變體中引入額外的N679K突變可能使病毒再次對(duì)宿主細(xì)胞糖基化的調(diào)節(jié)敏感。
圖3. 多堿基切割位點(diǎn)附近的突變改變了GalNAc-T3和T7的糖基化效率
4、在人肺細(xì)胞中過表達(dá)GalNAc-T3和T7抑制Omicron復(fù)制
作者進(jìn)一步探究了SARS-CoV-2的Omicron變異株對(duì)GalNAc-T3和GalNAc-T7在人肺細(xì)胞中的抑制作用的敏感性。為評(píng)估GalNAc-Ts對(duì)病毒復(fù)制的影響，作者用早期Omicron亞變體BA.1、原始的Wuhan-Hu1和α亞變體B1.1.7感染了人肺細(xì)胞系Calu-3細(xì)胞，并測(cè)定了GalNAc-T3和T7單獨(dú)或聯(lián)合過表達(dá)或不過表達(dá)的病毒滴度。在前24小時(shí)內(nèi)，GalNAc-T3和T7的共表達(dá)在MOI為0.1時(shí)，顯著抑制了BA.1的復(fù)制；感染后48小時(shí)，與野生型細(xì)胞(WT)相比，過表達(dá)GalNAc-T3和T7的Calu-3細(xì)胞中Omicron的病毒滴度降低了約76%。值得注意的是，單獨(dú)表達(dá)GalNAc-T7也表現(xiàn)出類似程度的病毒滴度降低。這一發(fā)現(xiàn)與GalNAc-T7在抑制刺突蛋白組裝成病毒樣顆粒(VLP)中的突出作用是一致的。收集Omicron病毒顆粒，并通過western blot分析了S和N蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)GalNAc-T3和T7共同過表達(dá)以及GalNAc-T7的單獨(dú)過表達(dá)均導(dǎo)致結(jié)合到Omicron病毒粒子中的S蛋白顯著減少，反映了GalNAc-T3和T7抑制S蛋白組裝成VLP。結(jié)合體外糖基化研究，這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，GalNAc-T3和T7對(duì)Omicron病毒的抑制可能是通過在刺突蛋白的Furin加工位點(diǎn)進(jìn)行糖基化來實(shí)現(xiàn)的。以上表明GalNAc-T3和T7介導(dǎo)的糖基化在病毒感染的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，目前流行的SARS-CoV-2變體Omicron仍然對(duì)這種調(diào)節(jié)有反應(yīng)，提示刺突蛋白多堿基位點(diǎn)的糖基化可用于未來的治療干預(yù)。
圖4. 在人肺細(xì)胞中過表達(dá)GalNAc-T3和T7抑制Omicron復(fù)制
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)GalNAc-T3和T7共同啟動(dòng)SARS-CoV-2刺突蛋白Furin切割位點(diǎn)的O-糖基化，從而抑制Furin加工，進(jìn)而抑制刺突蛋白與病毒樣顆粒的結(jié)合，并影響病毒感染。SARS-CoV-2病毒的α和δ變體的刺突蛋白的突變使病毒對(duì)GalNAc-T3和T7的糖基化產(chǎn)生抗性。在Omicron突變體中，額外的突變逆轉(zhuǎn)了這種抗性，使得刺突蛋白在體外對(duì)糖基化敏感，并對(duì)人肺細(xì)胞中GalNAc-T3和T7的表達(dá)敏感。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了糖基化作為宿主細(xì)胞對(duì)抗SARS-CoV-2的防御機(jī)制的作用，并揭示了宿主與病毒之間的進(jìn)化相互作用。