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已有大量研究試圖通過單核RNA測序來揭示人類心臟的細胞異質(zhì)性，但由于轉(zhuǎn)錄因子檢測的局限性，心臟轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)尚未被系統(tǒng)的描述。中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院胡盛壽院士、李向杰副研究員和宋江平教授共同通訊在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF 40.8)上發(fā)表文章“PBX/Knotted 1 homeobox-2 (PKNOX2) is a novel regulator of myocardial fibrosis”，研究開發(fā)了一個強大的無偏倚的組織處理和單核轉(zhuǎn)錄組分析管道，提高了更多的轉(zhuǎn)錄因子和參與信號通路的基因的檢測；并表征了健康心臟的細胞組成，確定了主要決定細胞亞型身份和功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中一種新的調(diào)節(jié)因子PKNOX2被證明在成纖維細胞激活過程中具有纖維化抑制效力。

1. 健康心臟成纖維細胞群與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

作者建立了一個組織加工管道，用于核分離和snRNA-seq，并發(fā)現(xiàn)這種優(yōu)化的snRNA-seq技術(shù)應用于成人心臟的基因檢測結(jié)果優(yōu)于scRNA-seq技術(shù)，具有良好的穩(wěn)健性和可重復性。通過這種無偏倚的方案，作者表征了健康人類心臟的細胞組成，并研究了參與決定主要心臟細胞亞型的細胞身份和功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在表征健康心臟成纖維細胞群與轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，作者發(fā)現(xiàn)一種新的調(diào)節(jié)因子PKNOX2與健康心臟中成纖維細胞的生理激活有關(guān)。

2. PKNOX2在衰竭心臟纖維化過程中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)

作者接下來驗證這些轉(zhuǎn)錄因子在維持體內(nèi)平衡中的作用，對移植衰竭心臟進行了snRNA-seq分析。發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，移植衰竭心臟的成纖維細胞中鑒定出8個具有不同基因特征和豐富功能的成纖維細胞亞簇。偽時間分析觀察到從間充質(zhì)基質(zhì)細胞樣纖維母細胞（FB）到病變FB存在兩條主要軌跡，表明心力衰竭中存在復雜的多向重構(gòu)。軌跡1顯示纖維化評分從基底成纖維細胞到myoFB呈梯度增加，這可能反映了心肌纖維化形成過程起源于常駐成纖維細胞，此外POSTN和MEOX1的表達在成纖維細胞激活起始時間開始增加，而PKNOX2的表達在此時達到峰值，并從活化的FB到myoFB逐漸下降，這些結(jié)果提示PKNOX2可能具有負調(diào)控作用，特別是在從生理激活到病理性纖維化的過渡階段。為了驗證PKNOX2在心肌重構(gòu)過程中的表達模式，作者檢測了供體心臟左心室心肌、DCM心臟左心室心肌(DCM LV)和DCM心臟右心室心肌(DCM RV)的蛋白表達。發(fā)現(xiàn)PKNOX2在DCM RV成纖維細胞中顯著增加，并與POSTN共定位，但這種增加在嚴重纖維化的DCM LV成纖維細胞中消失。

3. 體外過表達PKNOX2抑制成年小鼠心臟成纖維細胞活化

為了驗證PKNOX2在成纖維細胞活化和纖維化形成中的功能，作者在體外和體內(nèi)進行了功能喪失和功能獲得的研究。使用siRNA在永生化成年小鼠心臟成纖維細胞(AMCF)中敲低PKNOX2的表達，發(fā)現(xiàn)SMAD2的表達和磷酸化水平均上調(diào)，同時纖維化標志物a-SMA的表達增加，提示纖維化TGF-β-SMAD2通路的激活導致PKNOX2功能不足。此外Pknox2的敲低可以誘導纖維化激活達到與TGF-β刺激相同的水平。但在Pknox2敲低的基礎(chǔ)上，TGF-β刺激并沒有誘導纖維化的增量激活。作者還通過Adv-PKNOX2 (維真提供)在AMCFs中過表達PKNOX2，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，纖維化激活標志物(Postn, Col3a1, Ltbp2)在PKNOX2過表達的細胞中被顯著抑制。通路富集分析顯示，下調(diào)基因參與細胞外基質(zhì)組織、間充質(zhì)細胞分化和膠原原纖維組織，而上調(diào)基因與細胞增殖相關(guān)。此外PKNOX2過表達抑制TGF-β誘導的纖維化基因表達和SMAD2通路激活。

4. PKNOX2過表達抑制TAC誘導的小鼠心臟纖維化

為了證實PKNOX2在病理性心肌纖維化中的作用，作者構(gòu)建了成纖維細胞特異性PKNOX2敲除小鼠，并通過主動脈橫縮(TAC)手術(shù)誘導心力衰竭模型。發(fā)現(xiàn)TAC術(shù)后4周，Pknox2 CKO小鼠的心重/體重比明顯高于對照組。體內(nèi)超聲心動圖評價證實，與對照組相比，Pknox2-CKO小鼠心肌功能下降，左心室增大。Masson染色顯示，Pknox2-CKO小鼠TAC誘導的心臟纖維化也明顯加重。Pknox2-KO小鼠中與纖維化和心力衰竭相關(guān)的基因和蛋白的表達也明顯上調(diào)。以上表明，PKNOX2的功能喪失加重了壓力過載引起的心臟纖維化和功能障礙。隨后作者利用AAV9-Postn-Pknox2-GFP（維真提供）在體內(nèi)過表達PKNOX2，發(fā)現(xiàn)PKNOX2過表達小鼠的心臟重量/體重比明顯低于對照組，心肌功能得到有效改善，并且減輕了TAC誘導的纖維化，纖維化和心力衰竭相關(guān)基因的表達也明顯下調(diào)。總體而言，這些結(jié)果表明Pknox2過表達減輕了壓力過載誘導的心臟纖維化。