新冠突變不斷升級，試劑盒加速疫苗效價評估-商家動態-資訊-生物在線

新冠突變不斷升級，試劑盒加速疫苗效價評估

作者：北京百普賽斯生物科技股份有限公司 2021-06-11T15:00 (訪問量:4552)

“內防反彈，外防輸入”是我國新冠疫情防控工作的重點，而近期散點疫情源頭均指向境外人和物的輸入。2021年5月30日，廣東衛健委通報了廣東新冠疫情“早茶傳播鏈”和“境外貨輪傳播鏈”兩條傳播鏈，感染者經基因測序結果為印度變異株（B.1.617）和英國突變株（B.1.1.7）。印度變異株B.1.617的發現是繼發現新冠病毒巴西突變株P.1、英國突變株B.1.1.7、南非突變株B.1.351和尼日利亞突變株B.1.525后，廣東報道檢測到的第五種國際主流新冠病毒突變株。

目前，越來越多的人正在接種疫苗以防護新冠疫情，據相關統計，中國已接種新冠病毒疫苗逾7.04億劑次。而原始野生型病毒也在不斷的進化，軍事醫學科學院微生物與流行病學研究所在《新英格蘭醫學雜志》上發表的文章，利用假病毒中和實驗對新冠康復病人及接種滅活疫苗的血清樣本進行了相關研究，報道了變異毒株可能會產生免疫逃逸。

突變毒株對體液免疫應答和抗體識別會有哪些影響？接下來有哪些思路可以防止變異毒株產生免疫逃逸？接下來介紹的文章進行了系統的研究論證。

2021年5月21日，北京大學生物醫學前沿中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）謝曉亮課題組與合作者共同在《Cell Research》發表文章。在本研究中，謝曉亮團隊利用高通量單細胞測序、冷凍電鏡、病毒中和實驗等多種技術手段解析了新冠病毒滅活疫苗（科興）和RBD亞單位重組蛋白疫苗（智飛）接種者以及新冠感染康復者血漿中的中和抗體對于目前流行新冠突變株（例如南非株）的應答情況。

1. 中和抗體（NAbs）對501Y.V2突變體的中和反應研究
謝曉亮團隊先通過流式細胞熒光分選技術（FACS）從科興和智飛兩款疫苗接種者以及新冠感染康復者的外周血單核細胞（PBMCs）中分離出RBD-和NTD-特異性記憶B細胞，再利用高通量單細胞測序，篩選并表達出了831個抗刺突蛋白抗體，并從中篩選出86個對新冠病毒野生型具有高中和活性的抗體。構建了攜帶501Y.V2（B.1.351）突變的SARS-CoV-2 VSV-假病毒，用于研究中和抗體（NAbs）對501Y.V2突變體的中和反應。

Fig.1.a. 80 種有效抗RBD NAbs對攜帶501Y.V2 RBD突變的假病毒的IC50變化。b. 80個抗RBD NAbs對上述突變體的IC50值的平均值。 c.抗NTD抗體對攜帶D614G或242-244Δ的假病毒的IC50值。
實驗結果顯示，在80個抗RBD NAbs中，有50個對攜帶K417N/E484K/N501Y突變的假病毒（RBD.V2）的中和作用降低了3倍，其中43個抗RBD NAbs的半最大抑制濃度（IC50）增加了10倍（Fig.1.a）。中和反應降低大部分是由E484K突變引起的，E484K突變可以完全抵消抗體的中和活性。N501Y和K417N突變同樣會導致降低中和作用，但程度都遠低于E484K突變（Fig.1.b）。抗RBD NAbs在對K417N/E484K/N501Y等RBD突變時表現出了高多樣性。另一方面，由于501Y.V2攜帶的NTD上的242-244Δ突變會改變NTD抗原熱點的蛋白構象，所以會導致抗NTD NAbs失去中和能力（Fig.1.c）。由此分析，抗NTD NAbs的多樣性遠少于抗RBD NAbs。

2. VH3-53/VH3-66基因型抗體對南非株中和能力研究
為了進一步證實抗RBD NAbs具有多樣性，實驗研究分析了18種VH3-53/VH3-66基因型抗體對南非株的中和能力。VH3-53/VH3-66型抗體是不同感染者體內共同出現的抗體，這些抗體在RBD上的表位和結構高度相同。盡管如此，VH3-53/VH3-66型抗體對突變株的反應性仍有所差異，例如：少數VH3-53/VH3-66不受突變株影響，多數VH3-53/VH3-66抗體對K417N/E484K/N501Y突變株失效。結構解析證明這部分失效的抗體主要是由于K417N突變降低了抗體互補決定區與RBD的極性相互作用引起的（Fig.2）。

Fig.2. VH3-53/VH3-66 NAbs和RBD之間相互作用的結構分析（RBD顯示為表面視圖，而NAbs顯示為帶狀;紅色實心矩形表示突變會導致抗體結合的顯著降低。紅色虛線矩形表示突變會導致抗體結合的輕微下降 )
3. 501Y.V2突變體對康復者和滅活疫苗接種者的影響
接下來，文章研究了501Y.V2突變體對康復者和滅活疫苗接種者的影響。在實驗中，康復者和滅活疫苗接種者的血漿對南非突變株均表現出中和活性下降的趨勢。E484K和N501Y突變導致血漿中和活性的喪失（E484K＞N501Y）；對于NTD突變，242-244Δ導致NT50滴度降低2-3倍。相比于普通流行株，新冠感染康復者和滅活疫苗接種者的血漿針對南非株的中和活性下降4倍左右。主要由E484K / N501Y和242-244Δ突變引起的，且中和作用效果減少是可疊加的（Fig.3）。

Fig.3. D614G突變體NT50變化總結（顏色漸變表示范圍從 +1（白色）?6.1（藍色）的倍數變化值。 此圖中的所有繪制值和水平條表示幾何平均值 ）
4. RBD亞單位重組蛋白疫苗ZF2001相關研究
文章還對RBD亞單位重組蛋白疫苗ZF2001進行了相關研究。根據實驗結果，ZF2001只受到RBD突變的影響,不受242-244Δ突變影響。研究者還在體外表達了兩個ZF2001疫苗所有富集克隆的抗體序列，測試了抗D614G和RBD.V2假病毒的抗體,其誘導的抗RBD中和抗體具有豐富的多樣性。

Fig.4. a. 通過假病毒中和實驗，ZF2001 疫苗接種者血漿/血清 D614G到501Y.V2 的 NT50 倍數變化; b. 通過真實病毒中和實驗，ZF2001 疫苗接種者血漿/血清從WT到 501Y.V2的 NT50 倍數變化

ZF2001疫苗接種者在假病毒和真實病毒檢測中對501Y.V2突變的耐受性比滅活疫苗接種者和康復者高（Fig.4）。這表明RBD疫苗對501Y.V2的具有高耐受性和中和活性，可能會成為對抗攜帶NTD突變（例如242-244Δ）的突變體的理想選擇。但RBD疫苗的療效和突變耐受性如何隨時間變化仍需進一步研究。

Fig.5. D614G突變體NT50變化總結（顏色漸變表示范圍從 +1（白色）?6.1（藍色）的倍數變化值。 此圖中的所有繪制值和水平條表示幾何平均值 ）
研究還發現，與標準的RBD重組蛋白亞基疫苗三劑免疫（第0天/30天/60天）相比，第三劑和第二劑重組蛋白疫苗免疫之間的接種間隙延長（第0天/30天/140天）會產生更強中和活性的抗體（Fig.5）。這種現象可能是由于在第三劑量加強之前通過連續超突變獲得了更多的成熟抗體。另外在6月4日的《新聞1+1》節目上，科興宣布其已經完成臨床二期研究，稱志愿者在接種兩針疫苗后3、6個月再次接種第三劑，免疫效果可增加10-20倍。而科興將將會在接下來的時間里對保護時效進行詳細的研究測試再建議接種第三劑的時間。所以，如果未來新冠突變株大流行，特別是對于攜帶能改變NTD抗原熱點蛋白構象突變的病毒株，注射第三劑RBD重組蛋白疫苗來加強免疫或是一種優化方案。

隨著世界上新冠病毒不斷進行新的突變及流行，突變株對疫苗的有效性已經構成了嚴峻的挑戰。阿斯利康和諾瓦瓦克斯南非進行的臨床實驗中發現，疫苗對南非突變株（B.1.351）有效性已經降低了。所以面對新冠突變株這一新的挑戰，更深入地評估疫苗的有效性及安全性，并針對突變株進行疫苗新的開發，應當是接下來研究的熱點方向。
為助力評估疫苗對新冠病毒變異株產生的中和保護能力，ACROBiosystems經過大量的實驗摸索，在開發針對Wild type毒株中和抗體檢測試劑盒（Cat. No. RAS-N022）的基礎上，成功開發出針對B.1.1.7（英國突變株），B.1.351（南非突變株），P.1（巴西突變株）的中和抗體檢測試劑盒。
檢測原理：
試劑盒應用競爭ELISA方法。樣本中的中和抗體與微孔板上固定的Human ACE2 Protein特異性競爭HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike。在450 nm處測定樣本吸光度值（OD 450 nm），樣本OD 450 nm與樣本中中和抗體的含量呈負相關。
產品特點：
  • 操作簡單，方便可靠
  • 可同時檢測90+樣本
應用場景：
可用于新冠疫苗的效價評估，對接種疫苗后血清樣本中的中和抗體進行檢測等，能夠顯著提高疫苗評價的效率和準確度，是對現有疫苗評價方式的重要補充。

產品列表

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驗證數據
經驗證，使用上述ELISA試劑盒檢測接種滅活疫苗的血清樣本對Wild type和B.1.1.7變異株的中和能力接近，但對B.1.351和P.1毒株的中和能力明顯下降（Fig.6）。

Fig.6. 新型冠狀病毒中和抗體滴度檢測試劑盒,包含WT-RBD（Cat. No. RAS-N022）、B.1.1.7 RBD（Cat. No. RAS-N028）、B.1.351 RBD（Cat. No. RAS-N031）、P.1 RBD（Cat. No. RAS-N034）、B.1.1.7 Spike（Cat. No. RAS-N036），B.1.351 Spike（Cat. No. RAS-N037）和P.1 Spike（Cat. No. RAS-N038），檢測56份接種滅活疫苗后的血清樣本中的中和抗體，以評估疫苗對SARS-CoV-2相關變異株（VOC）的療效。

新型冠狀病毒(B.1.1.7)中和抗體滴度檢測試劑盒（Spike RBD)（Cat.. No. RAS-N028）用于檢測中和抗體（Cat. No. S1N-M122, Cat. No. SPD-M128 和Cat. No. SPD-M180）對SARS-CoV-2 RBD/ACE2結合的抑制能力。結果表明三種抗體阻斷阻斷SARS-CoV-2 RBD/ACE2結合的能力強弱排序為：Cat. No. S1N-M122>Cat. No. SPD-M128>Cat. No. SPD-M180。

Fig.7. 新型冠狀病毒(B.1.1.7)中和抗體滴度檢測試劑盒（Spike RBD)（Cat.. No. RAS-N028）用于檢測中和抗體對SARS-CoV-2 RBD/ACE2結合的抑制能力.

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新型冠狀病毒（B.1.351）中和抗體滴度檢測試劑盒（Spike RBD）（Cat. No. RAS-N031）用于檢測中和抗體（Cat. No. S1N-M122, Cat. No. SPD-M128 和Cat. No. SPD-M180）對SARS-CoV-2 RBD/ACE2結合的抑制能力。如上圖所示，Cat. No. S1N-M122阻斷SARS-CoV-2RBD/ACE2結合的能力強于Cat. No. SPD-M128和Cat. No. SPD-M180。

Fig.8. 新型冠狀病毒（B.1.351）中和抗體滴度檢測試劑盒（Spike RBD）（Cat. No. RAS-N031）用于檢測中和抗體對SARS-CoV-2 RBD/ACE2結合的抑制能力。

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