骨骼存在于人和動物體內，為肌肉、肌腱和韌帶提供了附著點，從而使運動成為可能。骨骼細胞譜系涵蓋了在穩態和損傷期間分別維持和修復骨骼的多種細胞，包括成骨細胞、骨細胞和軟骨細胞，這些骨骼細胞類型主要參與骨骼和軟骨的形成，而負責骨骼吸收的破骨細胞則來自造血譜系。通過成骨細胞和破骨細胞活性之間的平衡來維持正常的骨穩態。骨骼系統通過其支撐身體、保護內臟器官、參與運動功能、造血功能以及調節礦物質平衡等主要作用來維持身體健康，但由于多種因素的相互作用，機體功能易出現退化，容易導致骨骼疾病的發生，對人們的生活造成諸多困擾。
AAV憑借安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣及表達穩定等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，目前已被廣泛應用于多種疾病的基因治療。本期我們將和大家一起學習AAV在骨骼系統中的應用方法。
溫馨提示：以上來自于文獻報道，AAV在骨骼系統中的轉導效率應結合血清型、啟動子及注射方式等多方面綜合考慮，建議在進行實驗前根據具體想要感染的組織細胞查閱相關文獻并進行預實驗的摸索。
一. AAV血清型
案例 1
研究團隊評估了在體外不同AAV血清型對小鼠顱骨成骨細胞（COB）、骨髓衍生的破骨細胞前體（BM-OCP）和軟骨細胞祖細胞（ATDC5）的轉導效率，發現rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV9，rAAVrh.10和rAAVrh.39這八種AAV載體能夠高效轉導COB。其中，rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7和rAAV9也能轉導BM-OCP，而rAAV1，rAAV6，rAAVrh.10和rAAVrh.39則能轉導ATDC5；此外，rAAV2和rAAV6.2實現了ATDC5細胞的有效轉導，但在COB中轉導效果較差。接著，將體外篩選出的八種血清型AAV通過關節腔注射到2月齡小鼠體內，發現僅AAV9能夠有效轉導成骨細胞、破骨細胞和骨細胞等。
（Yang YS, et al. Nat Commun.2019）
實驗動物
2月齡雄性小鼠
血清型
AAV1/4/5/6/7/9/rh.10/rh.39
啟動子
CB
注射方式
膝關節內注射
病毒用量
1×1011 、5×1012 GC/kg、10μL
案例 2
通過膝關節注射不同AAV血清型（AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 6.2, rh8, rh10, rh39, rh43）至不同樣本軟骨組織中，發現與其他AAV血清型相比，AAV2和AAV6.2在體內外軟骨細胞的基因遞送中均表現出很高的轉導效率。
不同AAV血清型在小鼠軟骨組織中的轉導效率比較
（Dong Suk Yoon,et al. Int. J. Med. Sci. 2021）
實驗動物
ICR小鼠
血清型
AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/6.2/rh8/rh10/rh39/rh43
注射方式
關節內注射
病毒用量
1×1010 GC，6μL
二. 啟動子
為增強AAV對骨骼系統的特異性靶向，除了可以選擇CMV等廣譜啟動子外，還有多種骨骼特異性啟動子：
體內用于靶向成骨細胞和骨細胞的啟動子概述
（Kitase Y, Prideaux M. Bone. 2023）
在CAG、Col2.3和Sp7三種啟動子的驅動下，將AAV8-tdTomato（5×1011vg）經尾靜脈注射至小鼠體內，檢測發現三種構建體均成功轉導脛骨細胞；值得注意的是，骨特異性啟動子Col2.3和Sp7驅動的tdTomato表達與成骨細胞標記物AP共定位且轉導水平相似。其中Col2.3介導骨膜和成骨細胞的轉導，而Sp7主要介導成骨細胞的轉導。
全身給藥后，攜帶骨細胞特異性啟動子的AAV8選擇性靶向成骨細胞
（ Lee, Lucinda R. , et al. Methods, Clinical Development. 2019）
三. 注射方式
針對骨骼系統的AAV注射方式可分為三種：針對骨骼系統特異性的骨關節腔注射、靜脈注射以及針對骨髓的骨內注射。關節腔注射（Intra-Articular Injection）是首選的給藥方法。與全身給藥相比，關節內注射降低了非靶器官發生不良事件的可能性，提高了治療藥物在關節腔內的有效濃度，并且降低了成本。通過該注射方式給藥AAV可以將基因高效的傳遞至關節，滑膜中的成纖維樣滑膜細胞（FLS）、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞和T細胞等均可被有效轉導。
操作步驟（以膝關節注射為例）：
1) 抓握固定小鼠，對膝關節作備皮處理；
2) 用75％乙醇消毒后，握緊小鼠下肢，屈曲60°；
3) 取微量注射器于髕骨下方腱外緣進針，稍向內下穿過關節囊后即感到有落空感，此時不再進針并緩慢注射，注射完畢后靜置10s；
4) 旋轉拔出注射器，對注射位置作75％乙醇消毒處理。
小鼠膝關節注射示意圖
（https://www.clodrosome.com/animal-injection/）