人類小腦包含多種神經元，與大腦的發育模式完全不同。本研究通過scRNA-seq，scATAC-seq 和空間轉錄組學分析了孕周（GW）13-18周的胎兒樣本，探索發展中的人類小腦細胞多樣性和發育程序。作者鑒定了跨物種保守的暫時性顆粒細胞祖細胞，并從多個角度對顆粒細胞(GC)和浦肯野細胞的特殊模式進行了解剖，并在凌唇中發現了一個新的潛在神經上皮細胞群。此外，作者多角度對比了各神經亞型的物種保守性。最后，作者解析了浦肯野細胞和單極刷狀細胞的各亞型的分子特征，并揭示了控制其多樣化的基因調控網絡。本研究提供了一個人胎兒小腦的多組學圖譜，加深了我們對人類小腦的發育和空間組織的理解。

scRNA-seq、scATAC-seq

1. 發育中的人類小腦的多組學分析

作者選取GW13-18周的胎兒小腦樣本進行scRNA-seq、空間轉錄組學分析（Stereo-seq）以及scATAC-seq。從62,247個高質量細胞中鑒定了GABA能神經元（如中間神經元、浦肯野前體細胞）、興奮性譜系細胞（如未成熟顆粒細胞、顆粒細胞祖細胞）以及HES1+祖細胞和膠質細胞，并識別了各細胞類型的特異性標記基因。RNA速率分析揭示了祖細胞分化軌跡，ATOH1+興奮性祖細胞（顆粒細胞系）在增殖期高表達G2/M期標志物（如TOP2A），而PTF1A+祖細胞比例較低；浦肯野前體細胞（PKCs）在GW13占比最高，隨后迅速減少，而未成熟顆粒細胞（UBCs）占比在GW16達到峰值?？臻g轉錄組學顯示GW13樣本中細胞類型呈多層環狀分布（如外顆粒層、內顆粒層），GW16樣本中可區分菱唇、浦肯野細胞層及核團區域，與解剖結構一致。scATAC-seq與scRNA-seq數據整合分析表明染色質可及性與基因表達譜高度相關。

2. GC譜系的發育軌跡和瞬時擴增祖細胞

NRN1+小腦興奮性神經元中，GC占比最高，隨后作者從多方面解析了GC的發育。通過細胞周期評分和擬時序分析，作者將GC譜系分為 增殖期祖細胞（AT+GCPs和ND+GCPs） 和后分裂成熟GCs。其中ND+GCPs（NEUROD1+祖細胞）具有增殖特征（表達S/G2/M期標志物），與AT+GCPs相比不表達SOX2，高表達ELAVL2，且在小鼠中具有跨物種保守性。NEUROD1 的表達早于其他成熟GC標記基因，可能在早期驅動分化?？臻g轉錄組數據揭示了 ND+GCPs與AT+GCPs的“內-外”分層分布（iEGL和oEGL），與小鼠中瞬時擴增祖細胞的空間定位一致。后分裂GCs特異性表達 PRPH（神經元中間絲蛋白），僅在iEGL表達，可作為iEGL標志物；而 SFRP1 與PRPH表達互補，提示功能分化。CPLX3（前iEGL特異性）和 SV2B（iEGL富集）參與神經遞質分泌調控，可能與PRPH形成蛋白互作網絡，協同調控GC遷移。整合多組學構建基因調控網絡，鑒定出 ATOH1、YBX3和MEF2C 等關鍵轉錄因子。 ND+GCPs中 Ras/Rap1信號通路 和趨化因子激活，調控神經分化形態變化，且該通路在人類和小鼠中保守。

3. GC亞群特征及其空間分布

小腦不同區域（如前葉、后葉、絨球小結葉）表現出獨特的基因表達模式。例如，BARHL1和TLX3在顆粒細胞祖細胞中互斥表達，分別在小腦前部和后部區域高表達?？辙D數據顯示，EBF2和HEY1富集于背內側區域（可能與蚓部相關），而PRR35在腹外側區域（半球）表達，揭示了顆粒細胞在前后軸（A-P）和背內側-腹外側軸（DM-VL）的異質性。單細胞數據顯示，TLX3在人類后葉和絨球小結葉均表達，但在小鼠中僅在后葉出現；PARM1在人類后葉和小鼠前葉富集，呈現相反的分布模式。這種差異提示小腦發育的分子機制可能存在物種特異性演化。整合單細胞多組學數據（scRNA-seq和scATAC-seq）發現，A-P軸分布受特定轉錄因子調控，這些因子可能通過調控增強子活性驅動區域特異性基因表達。

4. UBC譜系發育

UBC和GC都被認為是從菱形唇（RL）中的WLS⁺祖細胞產生的神經元譜系。作者鑒定出一類新型潛在神經上皮細胞群（UBCpro-1），高表達COL2A1、PIK3C2G及干性標記物（如SOX2、CYP26B1）。空轉數據顯示，COL2A1高表達于最內側區域，與CALCB（RL腹側區標記）和EOMES（RL亞腦室區標記）形成“由內向外”的分布模式，作者推測UBCpro-1可能分化為經典的WLS+CALCB+ UBC祖細胞（UBCpro-2）。此外，作者還發現了UBC的兩種潛在亞型：1. LMX1A+ UBC：與已知的GRM1+ UBC（谷氨酸能）特征相似；2. CNTNAP5+ UBC：可能為未成熟的CALB2+ UBC，高表達膽堿能突觸通路相關基因。EOMES和PBX3可能是控制所有UBC譜系分化的核心調節劑，而SP5可能對CNTNAP5⁺譜系的發展至關重要，且具有物種保守性。

5. VZ祖細胞與中間神經元發育

VZ可以產生多種類型的GABA能神經元，如PKC。除神經元外，VZ還生成非神經元細胞，如OLIG2+PDGFRA+少突膠質祖細胞，PIFO+RSPH1+室管膜祖細胞，Bergmann膠質細胞等。PKC在小腦回路中執行關鍵功能，本研究發現3種PKC分子亞型：PKC1：表達EBF2和IGF1，對應已知的Zebrin II陰性亞型；PKC2：表達LSAMP、PCP4L1；PKC3：表達SLA、PBX3和FGF3。作者推測PKC2與PKC3均屬于Zebrin II陽性亞型。POSTN（促進神經突生長）和IGSF21（調控抑制性突觸分化）沿A-P軸呈互補分布，暗示小腦前后區域PKCs的功能分化或發育差異。早期發育中CADM1（腹側富集）與PLCB4/CADM2（背側）沿D-V軸分離（人類GW13和小鼠E15.5均存在），但后期（GW16）逐漸模糊。此外CADM1作為自閉癥相關基因，其缺失可能導致小腦體積縮小及PKC突觸減少，提示其在早期PKC空間組織中的潛在作用。整合scRNA-seq與scATAC-seq數據發現，EBF2通過遠端增強子激活SEMA3A，與小鼠中Ebf2缺失導致Sema3a+ PKCs減少的結果一致，而NR2F2和ZNF664可能參與不同PKC亞型的分化調控。

參考文獻：

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