子宮內(nèi)膜異位癥（EM）是育齡女性常見疾病，在不孕女性中發(fā)病率為20%-50%，EM患者不孕風(fēng)險是無EM者的4 倍，但EM相關(guān)不孕機制尚未完全闡明，目前認(rèn)為卵泡發(fā)育異常和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是主要誘因。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致EM患者卵泡發(fā)育異常和卵母細(xì)胞質(zhì)量降低的重要因素，可通過抑制線粒體功能、干擾脂質(zhì)代謝、加速顆粒細(xì)胞（GCs）衰老等損害卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量；GCs作為卵泡重要組成，通過縫隙連接和旁分泌為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量，其衰老與EM相關(guān)不孕密切相關(guān)。
2025年8月，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院張松英、戴永東、周楓共同通訊在Advanced Science (IF 14.1)在線發(fā)表題為“EETs Reduction Contributes to Granulosa Cell Senescence and Endometriosis-Associated Infertility via the PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway”的研究論文。首次系統(tǒng)闡明EM相關(guān)不孕中的氧化脂質(zhì)譜，明確14,15-EET的抗GC衰老作用，揭示 ROS-EZH2/H3K27Me3-EPHX2-EET惡性循環(huán)機制，為EM相關(guān)不孕提供新治療靶點，并證實了TPPU和BEZ-235的潛在治療價值。
· 維真助力·
基因信息
EZH2：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶
EPHX2：可溶性環(huán)氧化物水解酶
病毒產(chǎn)品
LV-sh-EZH2、LV-sh-EPHX2、LV-sh-NC ;
LV-EZH2、LV-EPHX2、LV-NC
感染細(xì)胞
小鼠卵巢顆粒細(xì)胞（mGC）
MOI
10
WB檢測LV-sh-EZH2、LV-sh-EPHX2的敲低效果
研究結(jié)果
1、Ezh2活性降低通過減少Ephx2基因啟動子的H3K27Me3修飾上調(diào)EPHX2表達水平
研究人員通過對不孕婦女的卵泡液（FF）、腹膜液 (PF) 和卵巢顆粒細(xì)胞 (GC) 進行LC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)氧化脂質(zhì)14,15-EET水平在EM患者中顯著下降，并與IVF結(jié)局呈正相關(guān)。使用14,15 EET預(yù)處理可通過提高mGCs的抗氧化能力和ATP水平，減輕過度氧化應(yīng)激引起的線粒體功能障礙和ROS誘導(dǎo)的卵巢GC衰老。EETs由花生四烯酸（AA）經(jīng)細(xì)胞色素P450單加氧酶（如CYP3A5）合成，再通過可溶性環(huán)氧化物水解酶（EPHX2）代謝為低活性的DHETs。研究發(fā)現(xiàn)，EM-GCs與Con-GCs中，CYP3A5的mRNA表達水平無顯著差異；但EPHX2的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，提示EM患者卵泡液中EETs減少源于EPHX2介導(dǎo)的代謝增加，而非合成異常。EM-GCs中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的蛋白表達水平顯著低于Con-GCs，同時其催化產(chǎn)生的抑制性組蛋白修飾標(biāo)志物H3K27Me3水平也顯著下降；而細(xì)胞衰老標(biāo)志物蛋白P21的表達水平顯著升高，暗示EZH2/H3K27Me3下調(diào)與EM-GCs衰老及EPHX2上調(diào)存在關(guān)聯(lián)。通過慢病毒介導(dǎo)的Sh-EZH2敲低mGCs中EZH2表達后，qRT-PCR結(jié)果顯示Ezh2 mRNA水平顯著降低，而Ephx2 mRNA水平顯著升高；Western blot同樣證實Sh-EZH2處理組的EZH2蛋白水平降低，EPHX2蛋白水平顯著升高。ChIP-PCR進一步驗證H3K27Me3與EPHX2啟動子的結(jié)合，表明EM-GC中Ezh 2活性下降導(dǎo)致Ephx2啟動子區(qū)域基于H3K27Me3的組蛋白甲基化減少，從而導(dǎo)致EPHX2蛋白表達水平增加，促進14,15-EET代謝，最終降低EM卵泡中14,15-EET水平。
EZH2/H3K27Me3組蛋白甲基化降低導(dǎo)致EM-GCs中EPHX2表達水平升高
2、EPHX2過表達加劇卵巢GC衰老，而其抑制劑TPPU減輕ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老
在誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后過表達EZH2，導(dǎo)致EPHX2和衰老標(biāo)記蛋白的表達水平降低。有趣的是，在氧化應(yīng)激條件下，EPHX2敲低上調(diào)EZH2/H3K27Me3表達水平，但抑制衰老標(biāo)記蛋白表達水平。此外，EPHX2敲低顯著升高14,15-EET濃度，并逆轉(zhuǎn)ROS誘導(dǎo)的GC衰老表型。進一步在體外過表達EPHX2會加劇GCs衰老，而其特異性抑制劑TPPU可通過上調(diào)EETs水平，緩解ROS誘導(dǎo)的GCs衰老。接下來，研究團隊建立EM小鼠模型，探索了TPPU處理（驗證了無明顯毒性）是否可以影響體內(nèi)細(xì)胞衰老，結(jié)果顯示TPPU可上調(diào)EM小鼠GCs中EETs、EZH2及H3K27Me3水平，降低EPHX2及衰老標(biāo)記蛋白的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明TPPU在減輕體內(nèi)mGC衰老中的重要作用，該功能可能通過上調(diào)EET水平來實現(xiàn)。進一步研究證實TPPU處理可延緩EM小鼠生育能力下降，通過調(diào)控卵巢微環(huán)境，顯著改善卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）的擴張異常，并抑制卵母細(xì)胞中活性氧的積累。
EPHX2過表達加重mGC衰老，而TPPU在體外挽救ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老
3、14,15-EET通過抑制EM中PI3K/AKT/mTOR信號通路的過度激活來減輕GC衰老
對EM-mGCs和Con-mGCs的卵巢GCs進行RNA測序，基因集富集分析顯示，與 Con-mGCs相比，EM-mGCs中衰老和細(xì)胞衰老相關(guān)基因集顯著富集，同時PI3K-Akt信號通路和mTOR信號通路被顯著激活。為明確PI3K/AKT/mTOR通路在14,15-EET抗衰中的核心作用，在14,15-EET預(yù)處理并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的mGCs中，使用AKT特異性激活劑 SC79重新激活 AKT。結(jié)果顯示，SC79 處理后，衰老標(biāo)志物蛋白表達水平顯著回升，細(xì)胞衰老表型再次出現(xiàn)，證實14,15-EET對GC衰老的緩解作用依賴于對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制。進一步用14,15-EET處理EM來源的mGC后，RNA-seq和KEGG分析顯示，PI3K-AKT信號通路的富集程度顯著降低。Western blot驗證，在氧化應(yīng)激條件下，14,15-EET預(yù)處理能有效抑制PI3K p85、p-AKT和p-mTOR的過度激活。這些結(jié)果共同表明PI3 K/AKT/mTOR信號通路在EM相關(guān)不育中的重要作用，這意味著14,15-EET可能通過抑制EM-GC中該通路的過度激活而起作用。在EM小鼠模型及體外實驗中，雙靶點I類PI3K/mTOR抑制劑BEZ-235通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路過度激活，顯著緩解GCs衰老，并改善COC擴張異常。
14,15-EET通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路過度激活挽救ROS誘導(dǎo)的mGC衰老
研究結(jié)論
本研究首次闡明ROS-EZH2/H3K27Me3-EPHX2-EET這一反饋環(huán)路形成了一個惡性循環(huán)，該循環(huán)可促進卵巢顆粒細(xì)胞衰老，并參與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕的發(fā)生發(fā)展。14,15-EET可通過抑制EM-GCs中PI3K-AKT-mTOR信號通路的異常激活，緩解顆粒細(xì)胞衰老并改善生育能力。