基因治療是將外源基因導入人體以糾正基因缺陷的方法，通過轉錄和翻譯實現對細胞基因表達的調控，從而合成特異性蛋白治療相關疾病。質粒DNA（Plasmid DNA, pDNA）是自然存在于細菌中的環狀DNA分子。其結構簡單、具有自主復制能力、可以攜帶治療基因，這些特性使其非常適合作為基因工程的載體。經基因工程改造過的pDNA，經過大量生產和純化后，可用作一些生產工藝的原料，例如生產腺相關病毒（AAV）和慢病毒載體、 mRNA 生產過程中的體外轉錄（IVT）反應及直接基因轉移等。目前，已經被廣泛用于基因治療的研究中。
各載體類型的基因治療藥物臨床試驗分布
Hemgenix: 是一款基于AAV5載體的基因療法，該藥物搭載有凝血因子IX（FIX）基因變體FIX-Padua，通過靜脈給藥，給藥后該基因可在肝臟中表達FIX 凝血因子，分泌后進入血液發揮凝血功能，從而達到治療目的，該藥于2022年11月獲FDA批準上市。
Ad5-nCoV：中國首例獲批的腺病毒載體新冠疫苗“克威莎”，在Ad5腺病毒缺陷型載體中插入了SARS-CoV-2病毒全長野生型S蛋白，疫苗進入體內后能夠同時引起體液免疫和細胞免疫反應。
RP-L201：是一種針對嚴重白細胞黏附缺陷癥I型（LAD-I）的基因治療產品，該療法由患者的造血干細胞組成，這些干細胞經過慢病毒載體的基因改造，含有ITGB2基因的功能拷貝，在去年的歐洲基因與細胞治療學會上，表示具有良好的臨床療效和安全性。
高質量的質粒DNA是基因治療生產中的關鍵組成部分，需求量很大，需要優化生產純化工藝以滿足治療藥物生產所需質量要求。大規模質粒DNA常在大腸桿菌（E. coli）中發酵生產，一般工藝流程為: 載體構建→種子庫的建立→發酵→收集菌體→裂解細胞固液分離→澄清與濃縮→分離純化→產品質量控制→分裝。（見下圖）
工業規模開發和生產質粒DNA載體的流程圖
雖然已建立大規模符合藥學規格的質粒 DNA 生產工藝，能滿足臨床需求，但在這些生產工藝中還存在一些難以克服的瓶頸，如: 載體構建、細胞裂解、細菌染色體 DNA 去除、細菌內毒素去除、生產過程中質量控制等。
特別是細菌染色體DNA去除。宿主DNA與質粒 DNA 具有相同的電荷，分子量的大小是它們僅有的不同之處。然而，分離過程中的剪切力使宿主 DNA 斷裂成與質粒 DNA 相近大小的片段(～10 kb) ，使得整個分離純化過程難度增加，可能會影響終產品的質量。同時，質量標準的制定直接關系到產品的質量控制，從產品雜質角度看，應在細菌內毒素、宿主菌蛋白質殘留量、外源DNA殘留量及殘留RNA等方面嚴格控制。
綜上，隨著基因治療的進一步發展，質粒DNA臨床用量需求不斷增加，對工業化生產提出了更高的要求: (1)質量分析對最高質量的基因藥物制劑的控制; (2)獲得高純度質粒DNA需減少相關污染物如宿主DNA、細菌內毒素等。除此之外，還應改善質粒保存條件，減少質粒在保存時遭到的破壞; 改善質粒載體系統，研究高效、新型載體，如去除細菌復制序列、抗性標記等細菌序列，以提高臨床用藥的安全性。
為支持基因治療藥物的相關研發，ACROBiosystems百普賽斯基于定量PCR法，專門設計開發了針對E. coli質粒DNA表達系統的超靈敏resDNA定量檢測試劑盒（貨號：OPA-O002），能夠專一快速的對中控樣品或原液成品中resDNA進行準確定量。
產品優勢
★ 高靈敏度：根據定量PCR方法開發，LLOD達到1 fg/μL；
★ 高一致性：在不同DN**段大小范圍內保持一致的性能；
★ 高特異性：與無關DNA無交叉反應，減少檢測的假陽性；
★ 嚴格質控：GMP廠房生產，符合ISO13485/9001質量管理體系;
★ 驗證完善：參考ICH Q2（R2）指導原則，可提供完善的驗證報告。
高靈敏度：LLOD達到1 fg/μL
High sensitivity and broad dynamic range using the E.coli resDNA Quantitative Kit (qPCR) (Cat. No. OPA-O002). (A) Typical analysis results obtained with Standard 1 (300 pg/μL) to 6 (3 fg/μL). (B) The standard curve of the 10-fold dilution series. PCR efficiency should be 90-110%.
高特異性：與無關DNA無交叉反應
Assay specificity. Standard curves generated using 10-fold serial dilution of E. coli genomic DNA (included in the kit).
高一致性：在不同DNA片段大小范圍內保持一致的性能
Consistent quantitation across a broad range of fragment sizes. Standard curves were generated using a 10-fold serial dilution of gDNA and fragmented DNA. Fragmented DNA was generated by sonicating total E. coli genomic DNA (8min, 13min, 20min). Fragmentation of the DNA was confirmed by agarose gel analysis.
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參考文獻:
1.Mohammadinejad R, Dehshahri A, Sagar Madamsetty V, et al. In vivo gene delivery mediated by non-viral vectors for cancer therapy. J Control Release. 2020;325:249-275.
2.Schmeer M, Buchholz T, Schleef M. Plasmid DNA Manufacturing for Indirect and Direct Clinical Applications. Hum Gene Ther. 2017;28(10):856-861.
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