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2025年6月3日，空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理與病理生理教研室聯(lián)合西安交通大學(xué)團(tuán)隊(duì)在Cell Metabolism（IF=27.7）在線發(fā)表題為“O-GlcNAcylation-mediated endothelial metabolic memory contributes to cardiac damage via small extracellular vesicles”的研究論文，本研究揭示了一種通過(guò)O-GlcNA酰化實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮代謝記憶的新機(jī)制，并確定了糖尿病EC衍生的小細(xì)胞外囊泡（sEVs）的記憶特征會(huì)導(dǎo)致心臟損傷。

In vivo

①基因信息  miR-15-16

病毒產(chǎn)品  AAV9-RGDLRVS-ICAM2-miR-15-16 sponges、AAV9-RGDLRVS-ICAM2-NC

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  6-8周齡雄性c57小鼠

注射方式  尾靜脈注射

注射劑量 100μL，1×10¹²vg/mouse

 

②基因信息 CaMK2a：鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 II α

病毒產(chǎn)品 Ad-ICAM2-CaMK2a-Flag-WT、Ad-ICAM2-CaMK2a-Flag-T306A

注射方式 頸動(dòng)脈注射

注射劑量 10μL，2.5×10¹⁰ pfu/ml

 

In vitro

基因信息 Stat1：一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子

病毒產(chǎn)品 Ad-Stat1

感染細(xì)胞 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (MAECs) 

MOI 40， 1.2×10¹⁰ PFU/ml

感染時(shí)間  48h

AAV感染后TUNEL和DAPI染色的代表性圖像

小鼠頸動(dòng)脈中CD31（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物）與CaMK2a-Flag共免疫熒光染色的代表性圖像

Ad-Stat1表達(dá)后 Stat1及miR-16-5p 等相關(guān)基因的水平檢測(cè)

 

糖尿病（DM）的患病率顯著增加，已成為一個(gè)主要的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。眾所周知，糖尿病顯著增加了心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，與缺血性心臟病或其他并發(fā)癥的存在無(wú)關(guān)；另一方面，臨床證據(jù)也表明，在心力衰竭患者中，糖尿病是不良預(yù)后的關(guān)鍵決定因素。盡管治療后血糖恢復(fù)正常，但高血糖產(chǎn)生的適應(yīng)不良特征仍然存在。據(jù)推測(cè)，血管系統(tǒng)中早期的高血糖可能會(huì)被內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）記住，從而導(dǎo)致隨后的心血管并發(fā)癥。這種現(xiàn)象被稱為“高血糖記憶”或“代謝記憶”，主要用于描述高血糖對(duì)血管并發(fā)癥的長(zhǎng)期負(fù)面影響。然而，代謝記憶在糖尿病心肌病或心力衰竭發(fā)展中的作用在很大程度上仍不清楚。

作者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在8周的高血糖（HG）應(yīng)激后，糖尿病來(lái)源的循環(huán)小細(xì)胞外囊泡（sEVs）對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)性不利影響，并在健康動(dòng)物中誘導(dǎo)心臟功能障礙，盡管后續(xù)血糖恢復(fù)正常。這表明HG誘導(dǎo)的循環(huán)sEVs表現(xiàn)出“記憶”特征，可能促使糖尿病患者殘留部分心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)。考慮到在糖尿病8周時(shí)sEVs產(chǎn)生的不良影響，對(duì)從8周糖尿病和非糖尿病對(duì)照組大鼠血漿中收集的sEVs進(jìn)行高通量RNA測(cè)序，鑒定發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p和miR-16-5p是代謝記憶產(chǎn)生的循環(huán)sEVs中的作用分子。miR-15b-5p和miR-16-5p被轉(zhuǎn)錄為miR-15-16，位于同一染色體區(qū)域，并且高度保守，考慮到兩者的協(xié)同作用，后續(xù)使用其模擬物或抑制劑探究了miR-15-16誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。結(jié)果表明，sEVs miR-15-16靶向FoxO1信號(hào)通路的一系列上游調(diào)節(jié)因子，并通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞中的FoxO1發(fā)揮促凋亡作用，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能障礙。

作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)代謝記憶誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌sEV miR-15-16，為了探索內(nèi)皮miR-15-16在體內(nèi)代謝記憶誘導(dǎo)的心臟功能障礙中的作用，作者利用AAV9介導(dǎo)miR-15-16海綿遞送給小鼠，實(shí)現(xiàn)了EC特異性的miR-15-16敲低。與NC海綿組相比，EC特異性miR-15-16海綿組血漿sEV miR-15-16的表達(dá)顯著降低，表明動(dòng)脈EC是代謝記憶誘導(dǎo)的血漿sEV miR-15-16的主要來(lái)源。此外，在DM或DM+Ins（代謝記憶動(dòng)物模型）組中，EC特異性miR-15-16敲低降低了心肌miR-15-16的表達(dá)，改善了心功能，并抑制了心肌細(xì)胞凋亡和FoxO1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的sEV miR-15-16參與了代謝記憶誘導(dǎo)的心臟損傷和功能障礙。

作者進(jìn)一步探究了代謝記憶促進(jìn)ECs分泌sEV miR-15-16的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HG對(duì)miR-15-16的作用可能通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化介導(dǎo)。糖尿病動(dòng)脈ECs中O-GlcNAc糖基化、CaMK2a活性、CaMK2a-Stat1結(jié)合以及Stat1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化均顯著升高，即使后期通過(guò)胰島素植入實(shí)現(xiàn)血糖正常化，這些指標(biāo)仍顯著升高。利用腺病毒在ECs中過(guò)表達(dá)Stat1，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Stat1可以與pri-miR-15-16啟動(dòng)子結(jié)合，以增強(qiáng)EC中sEV miR-15-16的分泌。隨后，作者通過(guò)抑制CaMK2a/Stat1探究了內(nèi)皮細(xì)胞CaMK2a-Stat1信號(hào)傳導(dǎo)在代謝記憶誘導(dǎo)的sEV miR-15-16分泌上調(diào)中的作用，結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞CaMK2a-Stat1信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)代謝記憶誘導(dǎo)的血漿sEV miR-15-16上調(diào)，并誘導(dǎo)心臟功能障礙。

前期工作鑒定Thr306為CaMK2a的潛在GlcNAc修飾位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變?cè)囼?yàn)。利用腺病毒在EC中表達(dá)外源野生型或T306A突變體CaMK2a-Flag，證明了Thr306位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾是CaMK2a促進(jìn)Stat1磷酸化及后續(xù)sEV miR-15-16分泌所必需的。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明O-GlcNAc修飾的CaMK2a在體內(nèi)具有很高的穩(wěn)定性。CaMK2a調(diào)節(jié)pri-miR-15/16的表達(dá)，并通過(guò)磷酸化Stat1影響心肌細(xì)胞。盡管糖尿病發(fā)病8周后開(kāi)始的晚期胰島素治療無(wú)法減輕代謝記憶和防止心臟功能障礙的發(fā)展，但是探究糖尿病發(fā)病初期早期胰島素治療或O-GlcNAc修飾抑制劑（OSMI，1 mg/kg/天）是否能有效阻斷內(nèi)皮記憶信號(hào)和心臟損傷具有重要意義。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)O-GlcNA化直接介導(dǎo)糖尿病誘導(dǎo)的有害變化，而早期血糖控制能夠抑制代謝記憶信號(hào)傳導(dǎo)并預(yù)防糖尿病誘導(dǎo)的損傷。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)化適用性，從糖尿病個(gè)體和健康志愿者中提取了血漿sEVs，并通過(guò)多元分析發(fā)現(xiàn)血漿sEV miR-16-5p和miR-15b-5p在預(yù)防糖尿病患者心臟功能障礙方面具有轉(zhuǎn)化潛力。

本研究表明糖尿病患者治療后盡管血糖恢復(fù)正常，但代謝記憶衍生的循環(huán)sEV miR-15-16對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生了深遠(yuǎn)而持續(xù)的有害影響。高糖誘導(dǎo)的CaMK2a/O-GlcNA化的正反饋回路即使在GLU正常化后也能維持內(nèi)皮CaMK2a-Stat1通路的激活，該通路介導(dǎo)代謝記憶并促進(jìn)sEV miR-15-16的持續(xù)釋放。靶向內(nèi)皮O-GlcNAc-CaMK2a-Stat1通路或sEV miR-15-16為消除糖尿病代謝記憶及其相關(guān)并發(fā)癥提供了一種有前景的治療方法。