神經(jīng)調(diào)質(zhì)如多巴胺（DA）通過與乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺（5-HT）等互作調(diào)控腦功能，但現(xiàn)有熒光傳感器局限于綠/紅光范圍，難以實(shí)現(xiàn)多色同步成像。2025年6月5日，北京大學(xué)李毓龍實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合國(guó)內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)，在Science雜志在線發(fā)表了題為“In vivo multiplex imaging of dynamic neurochemical networks with designed far-red dopamine sensors”的文章，研究開發(fā)了一種遠(yuǎn)紅光多巴胺探針HaloDA1.0，其結(jié)合了cpHaloTag化學(xué)染料和GRAB策略，具備高靈敏度、亞秒級(jí)響應(yīng)動(dòng)力學(xué)及遠(yuǎn)紅至近紅外光譜范圍。HaloDA1.0 可與現(xiàn)有紅綠熒光傳感器聯(lián)用，在培養(yǎng)神經(jīng)元、腦片和行為動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)多巴胺與其他神經(jīng)調(diào)質(zhì)及鈣離子、cAMP的多色成像，揭示了多巴胺在神經(jīng)化學(xué)網(wǎng)絡(luò)中的動(dòng)態(tài)互作機(jī)制，為解析復(fù)雜腦功能提供了新工具。
文章所用下述病毒產(chǎn)品由維真生物助力提供
AAV9-hSyn-HaloDA1.0 (7.73×1013 vg/ml)
AAV9-hsyn-hChR2(H134R)-mCherry (2.53×1013 vg/ml)
AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (9.12×1013 vg/ml)
AAV9-hSyn-NE2m (1.39×1013 vg/ml)
AAV9-hSyn-r5-HT1.0 (1.06×1013 vg/ml)
維真生物可提供本研究開發(fā)的遠(yuǎn)紅光多巴胺探針HaloDA1.0，歡迎咨詢~
01研究結(jié)果
1、HaloDA1.0傳感器的研制及體外特性研究
研究團(tuán)隊(duì)將人D1受體（D1R）的第三胞內(nèi)環(huán)（ICL3）替換為優(yōu)化的環(huán)形排列HaloTag蛋白（cpHaloTag），結(jié)合遠(yuǎn)紅光染料（主要是JF646），通過篩選2000多個(gè)變體，優(yōu)化插入位點(diǎn)、linker序列及關(guān)鍵氨基酸殘基，成功開發(fā)了遠(yuǎn)紅光多巴胺探針GRABHaloDA1.0（簡(jiǎn)稱為HaloDA1.0）。體外驗(yàn)證HaloDA1.0在HEK293T細(xì)胞中定位于質(zhì)膜，加入DA后熒光強(qiáng)度瞬時(shí)升高，最大熒光變化（ΔF/F?）約900%，半最大有效濃度（EC50）為150 nM。通過測(cè)試多種羅丹明衍生物，發(fā)現(xiàn)不同染料可調(diào)節(jié)傳感器光譜、響應(yīng)強(qiáng)度和親和力。隨后，研究團(tuán)隊(duì)表征了HaloDA1.0在HEK293T細(xì)胞和培養(yǎng)的神經(jīng)元中表達(dá)時(shí)的藥理學(xué)特性，動(dòng)力學(xué)以及與下游通路的偶聯(lián)，結(jié)果顯示該傳感器對(duì)DA具有高靈敏度和特異性，具有快速響應(yīng)動(dòng)力學(xué)，且不與下游信號(hào)通路偶聯(lián)。重要的是，在培養(yǎng)神經(jīng)元中同時(shí)表達(dá)HaloDA1.0（遠(yuǎn)紅光）、紅色5-HT傳感器（r5-HT1.0）和綠色NE傳感器（NE2m），成功實(shí)現(xiàn)三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的實(shí)時(shí)同步監(jiān)測(cè)，信號(hào)間無顯著串?dāng)_。
遠(yuǎn)紅色多巴胺傳感器的開發(fā)和表征
2.HaloDA1.0可在急性腦切片和斑馬魚中實(shí)現(xiàn)多重成像
為評(píng)估HaloDA1.0是否可以檢測(cè)內(nèi)源性DA釋放，將表達(dá)HaloDA1.0的AAV注射至小鼠NAc，3周后制備急性腦片，經(jīng)JF646染料標(biāo)記后，通過電刺激誘發(fā)DA釋放。結(jié)果顯示20 Hz電刺激可觸發(fā)HaloDA1.0熒光強(qiáng)度快速升高，響應(yīng)幅度與刺激脈沖數(shù)正相關(guān)，單個(gè)脈沖即可檢測(cè)到DA釋放；使用D1R拮抗劑SCH可完全阻斷熒光信號(hào)，證實(shí)信號(hào)源于內(nèi)源性DA釋放。在NAc共注射表達(dá)HaloDA1.0、rACh1h和eCB2.0的AAV，能夠靈敏報(bào)告電刺激引起的多巴胺、乙酰膽堿和內(nèi)源性大麻素的內(nèi)源動(dòng)態(tài)變化，揭示了三者差異化的釋放動(dòng)力學(xué)特征。此外，研究團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)綠色ATP探針、紅色鈣探針和遠(yuǎn)紅HaloDA1.0探針的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。結(jié)合三色成像，研究人員在斑馬魚電擊刺激和癲癇樣行為過程中，實(shí)時(shí)觀察到多巴胺、胞外ATP及神經(jīng)元鈣信號(hào)呈現(xiàn)同步化的釋放或活動(dòng)，并且三者在信號(hào)消退階段表現(xiàn)出不同的下降速率。
急性腦切片中使用HaloDA1.0進(jìn)行多重成像
3.HaloDA1.0可以檢測(cè)活體小鼠中多種神經(jīng)調(diào)質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化
在小鼠體內(nèi)使用基于cpHaloTag的傳感器需要將染料遞送到小鼠大腦，為了優(yōu)化HaloDA1.0的性能，研究團(tuán)隊(duì)在體內(nèi)系統(tǒng)地比較了各種遠(yuǎn)紅染料。在VTA中表達(dá)視紫紅質(zhì)-2，并在NAc中表達(dá)了HaloDA 1.0，其接收來自VTA的密集多巴胺能投射。在小鼠VTA注射表達(dá)光遺傳學(xué)激活蛋白ChR2的AAV，同時(shí)在NAc或mPFC表達(dá)HaloDA1.0，通過尾靜脈注射不同遠(yuǎn)紅光染料標(biāo)記傳感器，利用光纖記錄DA動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，SiR650標(biāo)記的HaloDA1.0探針可以在多巴胺能神經(jīng)元投射豐富的伏隔核和投射稀少的大腦皮層，均能特異性檢測(cè)光遺傳激活多巴胺神經(jīng)元引起的多巴胺釋放。進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)利用三光纖同步記錄小鼠在自發(fā)活動(dòng)、糖水獎(jiǎng)賞、足部電擊和可卡因注射條件下，DA、ACh和D1中型多棘神經(jīng)元（D1-MSN）內(nèi)cAMP動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示在生理行為過程中，多巴胺與乙酰膽堿通過協(xié)同作用對(duì)cAMP進(jìn)行調(diào)控，然而在可卡因刺激條件下，二者對(duì)cAMP的調(diào)控呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。
HaloDA1.0可用于檢測(cè)自由運(yùn)動(dòng)小鼠內(nèi)源性DA的釋放
02 研究結(jié)論
本研究成功開發(fā)了遠(yuǎn)紅光的多巴胺探針HaloDA1.0，這一新型探針可在細(xì)胞、腦片、斑馬魚及小鼠多系統(tǒng)中，靈敏且特異地報(bào)告多巴胺的動(dòng)態(tài)變化。通過與綠色和紅色熒光探針聯(lián)合應(yīng)用，HaloDA1.0讓研究者得以同步捕捉多種神經(jīng)化學(xué)分子的變化，深入解析它們的時(shí)空動(dòng)態(tài)特征和調(diào)控關(guān)系。這項(xiàng)成果是跨學(xué)科合作的重要產(chǎn)物，既拓展了活體化學(xué)研究的邊界，也為解析大腦復(fù)雜的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有力支持。
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