神經調質如多巴胺（DA）通過與乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺（5-HT）等互作調控腦功能，但現有熒光傳感器局限于綠/紅光范圍，難以實現多色同步成像。2025年6月5日，北京大學李毓龍實驗室聯合國內外多個團隊，在Science雜志在線發表了題為“In vivo multiplex imaging of dynamic neurochemical networks with designed far-red dopamine sensors”的文章，研究開發了一種遠紅光多巴胺探針HaloDA1.0，其結合了cpHaloTag化學染料和GRAB策略，具備高靈敏度、亞秒級響應動力學及遠紅至近紅外光譜范圍。HaloDA1.0 可與現有紅綠熒光傳感器聯用，在培養神經元、腦片和行為動物中實現多巴胺與其他神經調質及鈣離子、cAMP的多色成像，揭示了多巴胺在神經化學網絡中的動態互作機制，為解析復雜腦功能提供了新工具。

研究團隊將人D1受體（D1R）的第三胞內環（ICL3）替換為優化的環形排列HaloTag蛋白（cpHaloTag），結合遠紅光染料（主要是JF646），通過篩選2000多個變體，優化插入位點、linker序列及關鍵氨基酸殘基，成功開發了遠紅光多巴胺探針GRABHaloDA1.0（簡稱為HaloDA1.0）。體外驗證HaloDA1.0在HEK293T細胞中定位于質膜，加入DA后熒光強度瞬時升高，最大熒光變化（ΔF/F?）約900%，半最大有效濃度（EC50）為150 nM。通過測試多種羅丹明衍生物，發現不同染料可調節傳感器光譜、響應強度和親和力。隨后，研究團隊表征了HaloDA1.0在HEK293T細胞和培養的神經元中表達時的藥理學特性，動力學以及與下游通路的偶聯，結果顯示該傳感器對DA具有高靈敏度和特異性，具有快速響應動力學，且不與下游信號通路偶聯。重要的是，在培養神經元中同時表達HaloDA1.0（遠紅光）、紅色5-HT傳感器（r5-HT1.0）和綠色NE傳感器（NE2m），成功實現三種單胺類神經遞質的實時同步監測，信號間無顯著串擾。

2.HaloDA1.0可在急性腦切片和斑馬魚中實現多重成像

為評估HaloDA1.0是否可以檢測內源性DA釋放，將表達HaloDA1.0的AAV注射至小鼠NAc，3周后制備急性腦片，經JF646染料標記后，通過電刺激誘發DA釋放。結果顯示20 Hz電刺激可觸發HaloDA1.0熒光強度快速升高，響應幅度與刺激脈沖數正相關，單個脈沖即可檢測到DA釋放；使用D1R拮抗劑SCH可完全阻斷熒光信號，證實信號源于內源性DA釋放。在NAc共注射表達HaloDA1.0、rACh1h和eCB2.0的AAV，能夠靈敏報告電刺激引起的多巴胺、乙酰膽堿和內源性大麻素的內源動態變化，揭示了三者差異化的釋放動力學特征。此外，研究團隊還構建了同時表達綠色ATP探針、紅色鈣探針和遠紅HaloDA1.0探針的轉基因斑馬魚。結合三色成像，研究人員在斑馬魚電擊刺激和癲癇樣行為過程中，實時觀察到多巴胺、胞外ATP及神經元鈣信號呈現同步化的釋放或活動，并且三者在信號消退階段表現出不同的下降速率。

在小鼠體內使用基于cpHaloTag的傳感器需要將染料遞送到小鼠大腦，為了優化HaloDA1.0的性能，研究團隊在體內系統地比較了各種遠紅染料。在VTA中表達視紫紅質-2，并在NAc中表達了HaloDA 1.0，其接收來自VTA的密集多巴胺能投射。在小鼠VTA注射表達光遺傳學激活蛋白ChR2的AAV，同時在NAc或mPFC表達HaloDA1.0，通過尾靜脈注射不同遠紅光染料標記傳感器，利用光纖記錄DA動態。結果顯示，SiR650標記的HaloDA1.0探針可以在多巴胺能神經元投射豐富的伏隔核和投射稀少的大腦皮層，均能特異性檢測光遺傳激活多巴胺神經元引起的多巴胺釋放。進一步地，研究團隊利用三光纖同步記錄小鼠在自發活動、糖水獎賞、足部電擊和可卡因注射條件下，DA、ACh和D1中型多棘神經元（D1-MSN）內cAMP動態。結果顯示在生理行為過程中，多巴胺與乙酰膽堿通過協同作用對cAMP進行調控，然而在可卡因刺激條件下，二者對cAMP的調控呈現拮抗效應。

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