哺乳動物心臟再生能力有限，可導致心肌梗死后心力衰竭。相比之下，斑馬魚表現出顯著的心臟再生能力。據報道，多種細胞類型和信號通路參與這一過程。然而，對不同細胞和信號如何相互作用和協調調節心臟再生的全面分析目前依然缺乏研究。

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2022年5月18日，張巖課題組在Protein & Cell上發表了題為Single-cell transcriptome analyses of zebrafish heart development and regeneration的研究成果。

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該研究首先通過基因本體(GO)分析差異表達基因(DEGs)探索了未經處理的對照組細胞的轉錄特征。如預期的那樣，心房心肌細胞（CM-A）和心室心肌細胞（CM-V）都顯示出與心肌細胞發育與功能相關。心內膜細胞（EC）與血管發育關系密切，心外膜細胞（EP）主要參與細胞外基質(ECM)的形成，為心肌細胞提供信號增殖和成熟。心外膜源性細胞（EPDC）參與了與病灶粘附和ECM形成相關基因的調控。接下來該研究對來自甲硝唑（MTZ）干預過的細胞的DEGs進行GO分析。MTZ處理的CM-A特異性激活ATP代謝，這表明心臟損傷后能量代謝增加。再生的CM-V特異性誘導心臟細胞對心臟損傷的反應和參與細胞趨化的基因也在這些細胞中上調，表明細胞遷移對損傷后的細胞再生是必要的。這些結果表明，在心臟再生過程中涉及細胞合作和信號級聯的協調和編配。

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圖1 Tg的最大強度投影(vmhc:mCherry-NTR; amhc:EGFP)斑馬魚胚胎，顯示了正常心臟發育(A)和MTZ處理后心臟再生(B)的過程。同時，t-SNE分析顯示了相應發育或再生階段的細胞分布。

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近岸蛋白提供多種DNA/RNA提取及文庫構建試劑，可以滿足廣大研究者多方面的實驗需求。

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DNA/RNA測序相關產品

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該研究中將EPDC中再生特異性的細胞簇稱為再生誘導細胞(RIC)群體，為了探索RIC群體的潛在作用，基于CRISPR/Cas9基因組編輯系統的快速功能篩選策略被多次應用于該研究，對該群體中特異表達的基因進行了功能篩選。通過將Cas9蛋白與4種專門構建的gRNAs一起注入到單細胞受精階段的胚胎中以構建特定基因敲減的突變型，在備選的10個基因中，angpt4的突變型表現出最顯著的心臟再生表型。MTZ誘導后，40%以上的F0代胚胎心肌細胞表現出心臟再生障礙。由于angpt4表達的血管生成素4是一種分泌蛋白， 這表明Angpt4可能介導EPDC和其他心臟細胞類型之間的相互作用。進一步的免疫染色結果也證實了 scRNA-seq數據所顯示的angpt4在斑馬魚心臟再生過程中的EPDC中被誘導表達。

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圖2 （A）采用CRISPR/Cas9敲除策略進行功能篩選的10個基因t-SNE圖譜顯示其表達模式。

（B）注射Cas9蛋白和靶向各基因的4xgRNAs后WT和馬賽克斑馬魚胚胎心臟再生成功率.

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為了證實angpt4在心臟再生中的重要作用，該研究構建了一個穩轉突變系，該突變系帶有斑馬魚angpt4位點外顯子1的一個 2 bp的缺失(圖3A和3B)。angpt4純合突變胚胎發育未見明顯缺陷(圖3C)，成年突變體既能存活，又能繁育，心臟形態正常(圖3D和3E)，表明angpt4對斑馬魚心臟發育成熟不是必需的。

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圖3（A）和（B）：斑馬魚angpt4基因結構及CRISPR/Cas9靶點及突變等位基因序列示意圖。 在穩轉突變體的angpt4中發現了外顯子1存在2 bp的缺失。預測2-bp缺失的等位基因angpt4表達的部分缺失的蛋白產物。（C），（D）和（E）：穩轉突變體的形態學檢測結果和野生型和angpt4-/-斑馬魚胚胎心臟重(HW)與體重(BW)比值的定量結果。

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與angpt4在發育過程中的非必需的作用相反，在angpt4突變型胚胎中，MTZ誘導的心室損傷后的再生在很大程度上被限制，盡管心房在形態學上保持正常。Angpt4通過下游激活Tie2-MAPK通路發揮促進心臟再生作用。 該結果揭示了EPDC和EC之間通過Angpt4-Tie2-MAPK信號通路的細胞相互作用網絡，這對心臟再生至關重要。

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該研究中使用的Cas9（E365）蛋白來自近岸蛋白，同時，近岸蛋白還提供系列工具酶及重組蛋白等。

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CRISPR/Cas9相關產品：

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為了揭示angpt4敲除對受損心臟再生的影響的分子機制，以及angpt4-tie2-MAPK信號通路如何調控心臟再生，該研究評估了不同基因簇的表達特征。 通過檢測C3和C4簇之間的差異表達基因，發現C3高表達RA信號受體rxrga (retinoid x receptor, gamma a) 及其下游基因ctsk (cathepsin K)，表明retinoic acid（RA）信號通路在心室心肌細胞中被激活，并且這種激活依賴于Angpt4 。此外，RA信號已經被證實參與肢體再生和骨形成過程中collagenase-encoding組織蛋白酶基因的表達的調節。

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圖4 分離的CM-V細胞的t-SNE圖，顯示了WT組(未處理)、MTZ處理的WT組以及MTZ處理的angpt4⁺實驗組中CM-V細胞的分布。

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綜上所述，本文揭示了心臟再生過程中一個重要的分子和細胞協調網絡，該網絡由EPDC中angpt4的上調啟動，導致EC中MAPK信號的激活，進一步激活RA信號、膠原降解和 CM細胞增殖，最終導致受損心臟的結構和功能完全恢復。

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與野生型斑馬魚相比，angpt4過表達導致斑馬魚疤痕組織明顯更小，這表明過表達angpt4可以激活pTie2和pERK信號，促進斑馬魚心臟細胞再生(圖5)

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圖5 WT和angpt4 過表達的斑馬魚心臟組織再生情況對比

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另外, ejection fraction (EF)和fractional shortening (FS)都顯示與AAV9-GFP處理的對照組小鼠相比，注射AAV9-ANGPT4的老鼠在心肌梗死后心臟功能恢復明顯較好，表明 ANGPT4在體內的過表達可以促進成年小鼠的心臟修復功能，而ANGPT4表達的抑制則會導致心臟損傷后的再生障礙。 總之，我們揭示了angpt4啟動的EPDC-EC-CM細胞協作三種主要心臟細胞之間的網絡來協調和調節斑馬魚心臟的再生(圖6)。 該研究揭示了 angpt4基因在哺乳動物中是保守基因。 隨著對Angpt4的核心功能和保守特征和相關細胞協調作用機制的深入了解，未來有望提升人類心臟疾病的醫療技術。

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圖6 EPDC-EC-CM細胞間協作聯系和相關調節因子

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近岸蛋白相關產品

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蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。

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