對于CAR-T細(xì)胞來說，發(fā)揮腫瘤殺傷作用的有效成分是CAR陽性的T細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的包裝規(guī)格及臨床使用劑量是以CAR-T陽性細(xì)胞數(shù)表示的，因此，CAR轉(zhuǎn)染陽性率是CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量控制的必檢項(xiàng)，監(jiān)管部門建議應(yīng)采用流式細(xì)胞法（FACS）檢測CAR轉(zhuǎn)染陽性率。目前，針對CAR不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的檢測方法，包括針對CAR抗原結(jié)合位點(diǎn)的，比如CD19抗原和抗獨(dú)特型抗體，或針對輕鏈或鉸鏈區(qū)的抗Fab抗體、Protein L蛋白。?文末可下載細(xì)胞治療質(zhì)量控制相關(guān)指導(dǎo)原則和政策解讀相關(guān)文件哦~
那么，如何選擇合適的CAR表達(dá)檢測試劑呢？接下來，小編結(jié)合各種檢測試劑的檢測原理和優(yōu)缺點(diǎn)，幫您選擇出最合適的CAR表達(dá)檢測試劑~
通用型CAR檢測試劑
>> 抗Fab抗體
抗 Fab 抗體可識別抗體Fab段，可與含有Fab段可變區(qū)的scFv結(jié)合而達(dá)到檢測CAR表達(dá)的目的（圖1），具有一定的通用性，可檢測不同靶點(diǎn)的CAR。商品化的抗 Fab 抗體產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊且多數(shù)為多抗，批間一致性較差。來自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗體是目前使用最廣泛的抗Fab抗體，曾用于上市藥物Yescarta 的抗 CD19 CAR表達(dá)檢測[1]。
圖1 抗 Fab 抗體和protein L的CAR檢測結(jié)合位點(diǎn)
要點(diǎn)：
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染色前后需要嚴(yán)格洗滌，否則會與非 CAR的 IgG 樣蛋白交叉反應(yīng)而出現(xiàn)嚴(yán)重非特異；
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做多色染色時(shí)，與其他抗體或FcX封閉試劑不兼容；
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不能對雙靶點(diǎn)CAR細(xì)胞上的單獨(dú)CAR分別染色；
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不能對合成的CAR進(jìn)行檢測。
靶抗原蛋白
要點(diǎn)
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可與CAR特異性結(jié)合，具有CAR功能性驗(yàn)證作用；
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可檢測雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞中單CAR的表達(dá)；
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熒光標(biāo)記的靶抗原蛋白，可一步染色完成檢測CAR表達(dá)，減少非特異背景并節(jié)約時(shí)間；
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還可用于激活 CAR-T 細(xì)胞；
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價(jià)格相對Protein L等通用型檢測試劑較貴。
抗獨(dú)特型抗體
要點(diǎn)
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特異性結(jié)合CAR的scFv；
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高特異性和高靈敏度，且非特異背景低，適用于檢測臨床樣本；
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具有中和活性的抗獨(dú)特型抗體，可檢測到游離的CAR陽性T細(xì)胞；
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具有靶點(diǎn)專屬性，開發(fā)周期長；
圖2 靶點(diǎn)蛋白和抗獨(dú)特型抗體分別檢測CAR陽性率的原理
總結(jié)
總體來看，Protein L、抗Fab抗體、靶抗原蛋白以及抗獨(dú)特型抗體作為CAR表達(dá)檢測試劑均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合實(shí)際的應(yīng)用情況，有以下幾點(diǎn)建議供參考：
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盡量不使用Protein L或抗Fab抗體，避免高非特異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易分析；
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抗體篩選、方法開發(fā)、質(zhì)控等階段建議選用抗原蛋白，保證篩選到的scFv具有功能性作用和質(zhì)控方法的穩(wěn)定性；
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對于后期臨床階段來說，抗原蛋白為首選，來確保臨床PK等藥效學(xué)研究結(jié)果的可靠性，但對于臨床樣本，存在細(xì)胞組分比較復(fù)雜、CAR-T細(xì)胞含量較低等問題，導(dǎo)致CAR檢測難度加大，因此，可選擇靈敏度較高的抗獨(dú)特型抗體檢測臨床樣本。
此外，我們的產(chǎn)品經(jīng)PBMC批檢放行，均顯示與未轉(zhuǎn)染CAR的PBMC樣本無結(jié)合，高標(biāo)準(zhǔn)保證您的FACS檢測信號來自靶抗原與CAR-T細(xì)胞的特異性結(jié)合，加速您的藥物研發(fā)進(jìn)程。
熱門產(chǎn)品
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驗(yàn)證數(shù)據(jù)
> PE標(biāo)記CD19蛋白
可一步染色完成CD19 CAR表達(dá)檢測
> PE標(biāo)記CD19蛋白
與未轉(zhuǎn)染CAR的PBMC樣本無結(jié)合
> 抗FMC63抗體
經(jīng)FACS驗(yàn)證，可高靈敏檢測CD19 CAR表達(dá)
> 抗FMC63抗體
經(jīng)ELISA驗(yàn)證，具有中和活性，IC50 為0.084 μg/mL
福利來啦?。?/strong>
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參考文獻(xiàn)：
[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.
[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-speci?c monoclonal antibody to detect CD19-speci?c T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.
[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.
[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.
[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS
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