對于CAR-T細胞來說，發揮腫瘤殺傷作用的有效成分是CAR陽性的T細胞，CAR-T細胞產品的包裝規格及臨床使用劑量是以CAR-T陽性細胞數表示的，因此，CAR轉染陽性率是CAR-T細胞產品質量控制的必檢項，監管部門建議應采用流式細胞法（FACS）檢測CAR轉染陽性率。目前，針對CAR不同結構區域的檢測方法，包括針對CAR抗原結合位點的，比如CD19抗原和抗獨特型抗體，或針對輕鏈或鉸鏈區的抗Fab抗體、Protein L蛋白。?文末可下載細胞治療質量控制相關指導原則和政策解讀相關文件哦~
那么，如何選擇合適的CAR表達檢測試劑呢？接下來，小編結合各種檢測試劑的檢測原理和優缺點，幫您選擇出最合適的CAR表達檢測試劑~
通用型CAR檢測試劑
>> 抗Fab抗體
抗 Fab 抗體可識別抗體Fab段，可與含有Fab段可變區的scFv結合而達到檢測CAR表達的目的（圖1），具有一定的通用性，可檢測不同靶點的CAR。商品化的抗 Fab 抗體產品質量參差不齊且多數為多抗，批間一致性較差。來自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗體是目前使用最廣泛的抗Fab抗體，曾用于上市藥物Yescarta 的抗 CD19 CAR表達檢測[1]。
圖1 抗 Fab 抗體和protein L的CAR檢測結合位點
要點：
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染色前后需要嚴格洗滌，否則會與非 CAR的 IgG 樣蛋白交叉反應而出現嚴重非特異；
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做多色染色時，與其他抗體或FcX封閉試劑不兼容；
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不能對雙靶點CAR細胞上的單獨CAR分別染色；
-
不能對合成的CAR進行檢測。
靶抗原蛋白
要點
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可與CAR特異性結合，具有CAR功能性驗證作用；
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可檢測雙靶點CAR-T細胞中單CAR的表達；
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熒光標記的靶抗原蛋白，可一步染色完成檢測CAR表達，減少非特異背景并節約時間；
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還可用于激活 CAR-T 細胞；
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價格相對Protein L等通用型檢測試劑較貴。
抗獨特型抗體
要點
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特異性結合CAR的scFv；
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高特異性和高靈敏度，且非特異背景低，適用于檢測臨床樣本；
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具有中和活性的抗獨特型抗體，可檢測到游離的CAR陽性T細胞；
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具有靶點專屬性，開發周期長；
圖2 靶點蛋白和抗獨特型抗體分別檢測CAR陽性率的原理
總結
總體來看，Protein L、抗Fab抗體、靶抗原蛋白以及抗獨特型抗體作為CAR表達檢測試劑均有各自的優缺點，結合實際的應用情況，有以下幾點建議供參考：
-
盡量不使用Protein L或抗Fab抗體，避免高非特異，導致實驗結果不易分析；
-
抗體篩選、方法開發、質控等階段建議選用抗原蛋白，保證篩選到的scFv具有功能性作用和質控方法的穩定性；
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對于后期臨床階段來說，抗原蛋白為首選，來確保臨床PK等藥效學研究結果的可靠性，但對于臨床樣本，存在細胞組分比較復雜、CAR-T細胞含量較低等問題，導致CAR檢測難度加大，因此，可選擇靈敏度較高的抗獨特型抗體檢測臨床樣本。
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驗證數據
> PE標記CD19蛋白
可一步染色完成CD19 CAR表達檢測
> PE標記CD19蛋白
與未轉染CAR的PBMC樣本無結合
> 抗FMC63抗體
經FACS驗證，可高靈敏檢測CD19 CAR表達
> 抗FMC63抗體
經ELISA驗證，具有中和活性，IC50 為0.084 μg/mL
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參考文獻：
[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.
[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-speci?c monoclonal antibody to detect CD19-speci?c T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.
[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.
[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.
[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS
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