PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一種體外擴增DNA的方法。因其操作簡單，成本低，兼容性強等特點，已成為分子生物學的基礎工具，應用已滲透至生命科學的各個領域。
然而室溫下Taq DNA聚合酶具有殘留活性，會導致引物與模板非特異性結合，容易形成引物二聚體和錯配的非特異性擴增產物，進而影響到目標核酸的擴增效率。
Hot Start PCR法的出現動機源于解決常規PCR在室溫配制反應體系時發生的非特異性擴增問題，其核心原理是通過溫度依賴性抑制DNA聚合酶活性，確保擴增反應僅在高溫下啟動。
Hot Start PCR法的演化
通過物理、化學或生物手段在PCR循環前抑制DNA聚合酶活性，直至高溫激活階段釋放酶活，實現"低溫封鎖-高溫激活"的精準控制，從而降低了非特異性擴增，提高靶標核酸的擴增效率，降低假陽性出現的概率。
圖示 不同的抑制酶活性的方案
階段1 早期手動熱啟動方案
早期的學者為了解決非特異擴增的問題，通過蠟層隔離酶和反應液，然后通過高溫熔化使得試劑混合。存在耗時，操作復雜，容易污染等問題。
階段2 化學修飾
利用酸酐等化學小分子修飾DNA聚合酶上的賴氨酸殘基，從而在常溫下抑制DNA聚合酶的活性。存在高溫激活時間長等問題。
階段3 抗體修飾
單封閉抗體或雙封閉抗體會通過結合酶活性中心形成空間位阻抑制活性?？贵w在PCR反應初始熱激活步驟中變性并分離，從而使 Taq DNA 聚合酶發揮作用。由于抗體對熱極為敏感，因此抗體抑制酶的激活時間短，通常需要20s~5min即可完成。
階段4 適配體修飾
核酸適配體可逆結合酶活性中心位置抑制其功能?？稍谙鄬^低的溫度進行解離，釋放Taq酶活性。適配體修飾需依賴修飾核苷酸技術和高通量篩選平臺，面臨篩選成本高，穩定性差等挑戰。
綜上所述，Hot Start PCR法的誕生動機直指常規PCR的室溫活性殘留問題，其本質是通過溫度依賴性開關機制重塑酶活性的時空控制?？傮w而言，熱啟動 DNA 聚合酶不僅廣泛應用于傳染病領域，而且還廣泛應用于其他行業，例如法醫學、環境監測或基因測試。
隨著分子診斷的不斷發展，引物探針全預混試劑以方便快捷的優勢成為熱門需求。然而傳統Taq酶抗體原料通常僅封閉Taq酶的聚合活性，其5'-3'外切酶活性仍然暴露，導致與探針混合后，在低溫下仍發生探針切割釋放信號，造成假陽性的問題。
為了解決上述問題，近岸蛋白特別推出雙活性封閉的Taq酶抗體（目錄號：Z088），與Taq DNA Polymerase 結合后，能夠同時高效封閉其5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，從而抑制低溫條件下由引物的非特異性退火引起的非特異性擴增，和探針切割造成的假陽性，從而支持引物探針、酶以及Buffer等全預混qPCR/qRT-PCR體系的搭建。
產品特點
1）高特異性：與Taq 酶親和力高，有效避免非特異性擴增；
2）熱啟動迅速：95 ℃、30s即可啟動Taq酶活性；
3）支持全預混：可將除模板以外的所有組分預混成一管，使用便捷高效；
4）適用范圍廣：適配野生型及多種突變型Taq酶的封閉。
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產品性能
1 雙活性封閉性能優
將帶有熒光標記的模板分別與未封閉、單封閉抗體以及雙封閉抗體的Taq酶混合，50℃實時檢測熒光值變化。結果顯示，雙封閉抗體能夠很好的封閉Taq酶的5' - 3'聚合酶活性以及5' - 3'外切酶活性。同時使用雙封閉抗體，品牌A和品牌B同類產品分別封閉Taq DNA聚合酶，檢測封閉效果。結果顯示，近岸蛋白產品的封閉效果優于品牌A和品牌B。
圖示1. 不同活性位點封閉效果測試
圖示2. 封閉效果驗證
2 酶活釋放快
使用5U/ul 雙抗體封閉Taq DNA聚合酶，95℃下熱啟動30s。結果顯示酶活釋放速度快，95℃，30 s即可釋放酶活，不影響后續擴增。
圖示3. 酶活釋放效果測試
3 適配全預混
使用單封閉抗體，雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，混合ASFV的引物探針制備成全預混試劑，在37℃放置7d后，分別擴增2000拷貝，200拷貝和20拷貝ASFV質粒。結果顯示，雙封閉抗體全預混的基線更平穩，擴增平臺值更優，且37℃穩定性強，與-20℃保存試劑擴增無明顯差異。
圖示4. 不同抗體封閉的全預混效果測試
4 穩定性強
使用熱加速破壞性試驗測試雙封閉抗體的穩定性。在37℃放置2d、5d、7d和14d，通過熒光法檢測發現雙封閉抗體（Z088）在14d封閉效果表現優異，穩定性更高。
圖示5. 雙封閉抗體穩定性測試
5 適用范圍廣
使用雙封閉抗體分別封閉野生型和突變型TaqDNA 聚合酶，通過熒光法檢測封閉效果。結果顯示，對于不同類型的Taq酶，近岸蛋白雙封閉抗體封閉效果表現優異。
圖示6. 雙封閉抗體適配不同類型的Taq酶
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