Site 1 入門科普
肺大概有40種細胞類型，上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞和間質細胞等各司其職。而從宏觀角度，肺部可分為肺實質和肺間質。
肺實質由各級支氣管和肺泡組成，可完成氣體交換，維持機體供養，是肺部實現呼吸功能的關鍵部位。而肺泡更是肺部進行氣體交換的關鍵場所，主要由Ⅰ型肺泡上皮細胞（AT1）和Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2） 組成。
（1）AT1 cell：進行氣體交換，覆蓋肺泡表面積95%，是肺泡壁的結構支持，幫助維持肺泡的形狀和穩定性。
（2）AT2 cell：具有干細胞的特性，進行再生和修復受損肺組織的能力；生產和分泌肺泡表面活性物質。
肺實質結構及細胞類型[1]
肺類器官構建，則主要是氣道上皮細胞（源于支氣管）和肺泡上皮細胞（源于肺泡）中具有干性的細胞在體外擴增和分化來實現。在體外構建肺泡類器官，其主力細胞就是具有干細胞特性的AT2細胞。
成體細胞來源的肺類器官[1]
Site 2 培養步驟解析
組織取樣
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將小鼠斷頸處死并消毒，用剪刀從腹部到頸部做一個切口，暴露皮下組織。
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剪開腹部肌肉，將肝臟和腸道移開，從而暴露膈肌。
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剪開膈肌，暴露心臟和肺，并切斷腎動脈。從小鼠體內取出肺，轉移含D-PBS的100 mm培養皿中，分離肺的各個肺葉，并去除結締組織。
組織消化
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用剪刀將肺葉切碎成1-2 mm3的小塊。
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用防粘連潤洗液（Cat.No.:NPRS）潤洗1 mL吸頭（剪掉尖端）后，將組織小塊轉移至含有2-5 mL消化液（Cat.No.:TDS2）的離心管。
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將組織置于37℃培養箱中，孵育15 min。
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用1 mL吸頭將組織吹打約30次，顯微鏡下觀察到大量游離細胞時可停止消化。（消化時長最長不超過120 min）
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加入不少于組織消化液3倍體積的含10%胎牛血清的DMEM培養基以終止消化。
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用防粘連潤洗液（Cat.No.:NPRS）潤洗100 μm細胞篩及離心管后，過濾細胞懸液以去掉未消化完全的組織。
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將細胞懸液300 g離心5 min，吸棄上清液。
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進行細胞計數，調整細胞密度為3-5×105/mL。
種板培養
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將細胞懸液與NovoMatrix®基質膠（Cat.No.:NMO-G-PF）在冰上按照1：4輕輕吹打混勻（混勻時間不超過30 s以避免基質膠過早凝固）
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將混合懸液接種在24孔板底部正中央，每孔40 μL左右。
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將接種后的培養板倒置于37℃恒溫培養箱中，孵育15 min左右待基質膠凝固。
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每孔加入500 μL預熱的小鼠肺類器官完全培養基（Cat.No.：OCMMN03），確保基質膠完全浸在培養基中。
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將24孔板置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養并持續觀察。接種時形態如Figure 1所示。
Figure 1 提取出的小鼠肺原代細胞
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每2天更換一次培養基，更換培養基時應避免破壞基質膠。成熟的小鼠肺類器官如Figure 2所示。
Figure 2 成熟的小鼠肺類器官 (Day 8)
類器官的傳代
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吸棄原培養液，加入500 μL的細胞回收液（Cat.No.:OCRS)以確保完全浸沒基質膠，2 - 8℃孵育約30 min。
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使用防粘連潤洗液（Cat.No.:NPRS）潤濕 1 mL 的吸頭，每10 min吹打至基質膠至完全吹散，吹打過程避免產生氣泡。
注意：如30 min時仍能觀察到未溶解的基質膠，可適當延長10-30 min孵育時間。
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將所有懸液轉移到1.5 mL離心管中并吹打10次，4℃條件下250 g離心5 min。
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小心去除上清，加入500 μL預冷的PBS重懸類器官，4℃條件下250 g離心5 min；重復此步驟1次，徹底清洗類器官。
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加入平衡至室溫的小鼠肺類器官完全培養基（Cat.No.:OCMMN03），輕輕吹打重懸，按照 【種板培養】步驟進行接種培養。依據類器官的密度或狀態以 1：4~ 1：6 的比例進行傳代。
Figure 3 傳代后的小鼠肺類器官
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Site 4 專家1v1解答
原代細胞提取效率低，活性差？
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參考文獻
[1] Joe, Y. A., Lee, M. J., & Choi, H. S. (2024). Experimental Mouse Models and Human Lung Organoid Models for Studying Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Biomolecules & therapeutics, 32(6), 685–696.