技術資料來自novoprotein——專業的細胞因子生產廠商）

一、細胞因子的概念

細胞因子(cytokine)是由機體多種細胞分泌的小分子蛋白質，通過結合細胞表面的相應受體發揮以調節免疫應答為主的生物學作用。細胞因子具有非常廣泛的生物學活性，包括促進靶細胞的增殖和分化，增強抗感染和細胞殺傷效應，促進或抑制其它細胞因子和膜表面分子的表達，促進炎癥過程，影響細胞代謝等。

二、細胞因子的命名

細胞因子按其來源可分為：由單個核吞噬細胞產生的細胞因子稱為單核因子(monokine)；由淋巴細胞產生的細胞因子稱為淋巴因子(lymphokine)等。按其作用可分為干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子等。部分由不同細胞分泌的細胞因子，其基因及編碼蛋白與結構清楚者，在免疫調節、造血和炎癥中發揮重要作用，又稱為白細胞介素(interleukin，IL)。也可以依據結構或者其受體結構分類，我們的趨化因子目前沒有受體產品。

三、細胞因子的特征

1、低分子量；一般為＜60kD的多肽或糖蛋白。多以單體形式存在，少數為二聚體，三聚體。
2、天然細胞因子由抗原、絲裂原或其他刺激物活化的細胞所分泌，通過旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或內分泌(endocrine)方式在局部發揮短暫作用。
3、一種細胞因子可由多種細胞產生，同一種細胞可產生多種細胞因子。
4、需通過與靶細胞表面相應受體結合后發揮其生物學效應。
5、具有高效性、多效性、疊性、拮抗性、協同性和網絡性。

四、細胞因子的分類
1、白細胞介素(interleukin，IL-s)
最初是指由白細胞產生又在白細胞間發揮作用的細胞因子。

2、干擾素（interferon,IFN)
最早發現的細胞因子，有干擾病毒感染和復制的能力。分α、β和g三種類型。

3、腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)
1975年發現的一種能使腫瘤發生出血壞死的物質。

4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)
指能夠刺激多能造血干細胞和不同造血祖細胞增殖分化，在半固體培養基中形成相應細胞集落的細胞因子。包括G-CSF（粒細胞）、M-CSF（巨噬細胞）、GM-CSF（粒細胞、巨噬細胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、紅細胞生成素(EPO)、干細胞生長因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。

5、趨化因子(chemokine)
主要功能是招募血液中的單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等進入特定的淋巴器官和組織以及感染發生的部位。根據趨化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和數量，可分為CC、CXC、C、CX3C四個亞家族。

6生長因子(growth factor，GF)
生長因子(GF)是具有刺激細胞生長作用的細胞因子。

五、細胞因子的生物學活性
1.介導自然免疫、參與抗腫瘤和抗感染
2.調節T、B細胞活化、生長和分化，介導細胞免疫和體液免疫
3.刺激造血生成、刺激骨髓祖細胞生長和分化為各種成熟血細胞
4.在炎癥、感染和內毒素血癥中的作用
5.在超敏反應和自身免疫病中的作用
6.細胞因子通過激活其相應受體（CKR），導致細胞的增殖與分化或分泌某種蛋白質。

六、四種蛋白表達體系比較

遺傳背景及基因表達調控機制清楚

七、生物學活性質控
不同的細胞因子用不同的方法進行相應的體外（in vitro）或體內（in vivo）活性檢測。
重組細胞因子活性通常會以ED50（半數有效濃度）或units（活性單位）來標識。因此1mg細胞因子中所含的活性單位（units）可以理解為將1mg/ml細胞因子原液稀釋成ED50的稀釋倍數 注：ED50 (半數有效濃度): 可誘導50%最大反應的細胞因子濃度

1) ED50=1.0ng/ml, 則1.0 ng/ml相當于1 unit;
2) 1mg PDGF-BB中含有多少個units呢?
Units=1mg/1.0 ng/ml=106
3)若測定的ED50為0.5ng/ml對應比活性為：
1mg/0.5ng/mg=2X106

八、純度測定
純度：由以下方法測定純度大于95.0%
（a）高效液相色譜（SEC-HPLC）；
（b）還原和非還原銀染SDS-PAGE。

• SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構
• 強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂

變性凝膠電泳：
蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。

非變性凝膠電泳：

非變性凝膠里面沒加變性劑。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗，如EMSA。由于沒有變性劑的原因非變性膠電泳時除了與蛋白分子量有關也會受都電荷的影響，因此對蛋白等電點的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時需要倒轉電泳時的正負極。從跑的膠來看，變性膠會比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來則比較粗糙。

1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。
2. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS，也沒有巰基乙醇。
3. 在非變性凝膠中蛋白質的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離只與其分子量有關。
4. 非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環境下進行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。
5. 因為是非變性凝膠電泳，所有的電泳時候電流不能太大，以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進行，這樣才可以保持蛋白質的活性，也可以降低蛋白質的水解作用。這點跟變性電泳也不一樣。

九、分子量
還原SDS-PAGE測定
本法測得的分子量，除單鏈蛋白質外，均不是天然蛋白質的完整分子量，而是組成這些蛋白質的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構象異常，或帶有大輔基的蛋白質不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。對一些結構蛋白如膠原蛋白等也不適用。

準確度比較：點噴霧質譜法>還原的SDS-PAGE>非還原的SDS-PAGE>HPLC

此法測得的表觀分子量由于翻譯后修飾（磷酸化，糖基化），剪切，異構等原因，會比預期的分子量偏大。如：p53蛋白，其表觀分子量是53kDa（這也是該蛋白名字的由來），但是根據氨基酸序列計算得到的分子量卻是43kDa。

十、N末端氨基酸序列分析
重組蛋白經N末端氨基酸序列分析；必要時應用SDS-PAGE, RP-HPLC和質譜（MS）檢測其真實性。

十一、內毒素對活性的影響
內毒素（Endotoxin），是革蘭氏陰性菌細胞壁的產物。當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時，表現毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。
內毒素與細胞膜上的受體結合引起免疫反應，對細胞有較強的毒性作用。我們的產品均采用多種方法有效去除內毒素,使用鱟試劑（Limulus Amebocyte,LAL）測定含量小于0.1ng/ug (1 EU/ug)。

十二、貯存及復溶
產品均為無菌凍干粉劑，調整PH和鹽濃度經0.2um過濾后分裝凍干。
請使用手動化霜冰箱，由于每次凍融都會造成蛋白的部分變性，所以要適量分裝盡量避免反復凍融。
干粉狀態在室溫下存放3周，不影響活性；放于-18℃以下，可穩定保存至少一年。
復溶時依據說明書，大多數溶解在滅菌超純水（18MΩ.cm）中，濃度不低于100μg/ml，以待進一步稀釋至工作濃度。蛋白質在高濃度下穩定，所以有些加入載體蛋白，但是可能會對實驗造成影響。我們的產品均不含carrier protein或其他添加物（如BSA、HAS、蔗糖等），而是以低鹽的形式做凍干處理，微量的細胞因子在凍干過程中會沉積于管內，形成很薄或不可見的蛋白層。所以使用前先離心20-30s，使附于管蓋或管壁的蛋白集于管底，有些產品復溶需要加入醋酸，因為含PBS的凍干粉中性時容易吸附管壁，加入酸溶于液體中，表面活性劑也防止吸附。
復溶后的細胞因子，4℃可穩定儲存 2周；長期保存請分裝后存放于-20℃以下，可穩定保存至少三個月。最好在-80℃保存。分裝時濃度要>100ng/ul，體積要>20ul。

十三、重組細胞因子的交叉活性

• 大多數人類細胞因子對小鼠細胞都有活性。
• 許多小鼠細胞因子對人類細胞也有活力表現，但是比相應人類細胞因子活力低。
• 一些人類的細胞因子如IL-7在小鼠細胞中表現出比小鼠細胞因子更高的比活力。
• 干擾素、GM-CSF、IL-3 和IL-4 有物種特異性，對于非人類細胞幾乎沒有活性。
• 成纖維細胞生長因子和神經營養因子是高度保守的，在其它的動物細胞中也能表現很好的活性。
  

十四、細胞因子的應用

• 免疫學實驗
• 細胞培養實驗
• 細胞治療
• 細胞調亡的研究
• 干細胞培養與擴增分化（ips）
• 細胞因子的功能性分析
• 體外生化分析
• 作為抗原，應用于生產高質量抗體
• 抗體分析中作為陽性對照
• ELISA和其他分析方法中作為標準品使用
• 蛋白-蛋白相互作用

來源網址：http://www.sinobio.net/news/latestnews/cytokine_js.html