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一、細(xì)胞因子的概念
細(xì)胞因子(cytokine)是由機(jī)體多種細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，通過結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)揮以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答為主的生物學(xué)作用。細(xì)胞因子具有非常廣泛的生物學(xué)活性，包括促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)抗感染和細(xì)胞殺傷效應(yīng)，促進(jìn)或抑制其它細(xì)胞因子和膜表面分子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥過程，影響細(xì)胞代謝等。
二、細(xì)胞因子的命名
細(xì)胞因子按其來源可分為：由單個(gè)核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子稱為單核因子(monokine)；由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子稱為淋巴因子(lymphokine)等。按其作用可分為干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子等。部分由不同細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其基因及編碼蛋白與結(jié)構(gòu)清楚者，在免疫調(diào)節(jié)、造血和炎癥中發(fā)揮重要作用，又稱為白細(xì)胞介素(interleukin，IL)。也可以依據(jù)結(jié)構(gòu)或者其受體結(jié)構(gòu)分類，我們的趨化因子目前沒有受體產(chǎn)品。
三、細(xì)胞因子的特征
1、低分子量；一般為＜60kD的多肽或糖蛋白。多以單體形式存在，少數(shù)為二聚體，三聚體。
2、天然細(xì)胞因子由抗原、絲裂原或其他刺激物活化的細(xì)胞所分泌，通過旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或內(nèi)分泌(endocrine)方式在局部發(fā)揮短暫作用。
3、一種細(xì)胞因子可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，同一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。
4、需通過與靶細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
5、具有高效性、多效性、疊性、拮抗性、協(xié)同性和網(wǎng)絡(luò)性。
四、細(xì)胞因子的分類
1、白細(xì)胞介素(interleukin，IL-s)
最初是指由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。
2、干擾素（interferon,IFN)
最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，有干擾病毒感染和復(fù)制的能力。分α、β和g三種類型。
3、腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)
1975年發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)。
4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)
指能夠刺激多能造血干細(xì)胞和不同造血祖細(xì)胞增殖分化，在半固體培養(yǎng)基中形成相應(yīng)細(xì)胞集落的細(xì)胞因子。包括G-CSF（粒細(xì)胞）、M-CSF（巨噬細(xì)胞）、GM-CSF（粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、紅細(xì)胞生成素(EPO)、干細(xì)胞生長因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。
5、趨化因子(chemokine)
主要功能是招募血液中的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進(jìn)入特定的淋巴器官和組織以及感染發(fā)生的部位。根據(jù)趨化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和數(shù)量，可分為CC、CXC、C、CX3C四個(gè)亞家族。
6生長因子(growth factor，GF)
生長因子(GF)是具有刺激細(xì)胞生長作用的細(xì)胞因子。
五、細(xì)胞因子的生物學(xué)活性
1.介導(dǎo)自然免疫、參與抗腫瘤和抗感染
2.調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞活化、生長和分化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫
3.刺激造血生成、刺激骨髓祖細(xì)胞生長和分化為各種成熟血細(xì)胞
4.在炎癥、感染和內(nèi)毒素血癥中的作用
5.在超敏反應(yīng)和自身免疫病中的作用
6.細(xì)胞因子通過激活其相應(yīng)受體（CKR），導(dǎo)致細(xì)胞的增殖與分化或分泌某種蛋白質(zhì)。
六、四種蛋白表達(dá)體系比較
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表達(dá) |
細(xì)胞 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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原核 |
E. coli |
繁殖快、成本低、產(chǎn)量高 遺傳背景及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制清楚 易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉 |
蛋白常為包涵體，純化困難 |
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酵母 |
Pichia |
使用簡單，表達(dá)量高，His-tag便于純化，一定的翻譯后加工可進(jìn)行糖基化修飾，操作簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn) |
有時(shí)會出現(xiàn)蛋白切割問題 |
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昆蟲 |
High-5 |
產(chǎn)量高 ，翻譯后加工與哺乳動物相似 |
蛋白活性不如哺乳動物 |
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哺乳 |
CHO HEK293 |
完善的翻譯后加工，活性接近天然蛋白 |
周期長、技術(shù)要求高 |
七、生物學(xué)活性質(zhì)控
不同的細(xì)胞因子用不同的方法進(jìn)行相應(yīng)的體外（in vitro）或體內(nèi)（in vivo）活性檢測。
重組細(xì)胞因子活性通常會以ED50（半數(shù)有效濃度）或units（活性單位）來標(biāo)識。因此1mg細(xì)胞因子中所含的活性單位（units）可以理解為將1mg/ml細(xì)胞因子原液稀釋成ED50的稀釋倍數(shù) 注：ED50 (半數(shù)有效濃度): 可誘導(dǎo)50%最大反應(yīng)的細(xì)胞因子濃度
1) ED50=1.0ng/ml, 則1.0 ng/ml相當(dāng)于1 unit;
2) 1mg PDGF-BB中含有多少個(gè)units呢?
Units=1mg/1.0 ng/ml=106
3)若測定的ED50為0.5ng/ml對應(yīng)比活性為：
1mg/0.5ng/mg=2X106
八、純度測定
純度：由以下方法測定純度大于95.0%
（a）高效液相色譜（SEC-HPLC）；
（b）還原和非還原銀染SDS-PAGE。
- SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)
- 強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂
變性凝膠電泳：
蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。
非變性凝膠電泳：
非變性凝膠里面沒加變性劑。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗(yàn)，如EMSA。由于沒有變性劑的原因非變性膠電泳時(shí)除了與蛋白分子量有關(guān)也會受都電荷的影響，因此對蛋白等電點(diǎn)的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時(shí)需要倒轉(zhuǎn)電泳時(shí)的正負(fù)極。從跑的膠來看，變性膠會比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來則比較粗糙。
1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。
2. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS，也沒有巰基乙醇。
3. 在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)。
4. 非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。
5. 因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所有的電泳時(shí)候電流不能太大，以免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的水解作用。這點(diǎn)跟變性電泳也不一樣。
九、分子量
還原SDS-PAGE測定
本法測得的分子量，除單鏈蛋白質(zhì)外，均不是天然蛋白質(zhì)的完整分子量，而是組成這些蛋白質(zhì)的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構(gòu)象異常，或帶有大輔基的蛋白質(zhì)不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。對一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等也不適用。
準(zhǔn)確度比較：點(diǎn)噴霧質(zhì)譜法>還原的SDS-PAGE>非還原的SDS-PAGE>HPLC
此法測得的表觀分子量由于翻譯后修飾（磷酸化，糖基化），剪切，異構(gòu)等原因，會比預(yù)期的分子量偏大。如：p53蛋白，其表觀分子量是53kDa（這也是該蛋白名字的由來），但是根據(jù)氨基酸序列計(jì)算得到的分子量卻是43kDa。
十、N末端氨基酸序列分析
重組蛋白經(jīng)N末端氨基酸序列分析；必要時(shí)應(yīng)用SDS-PAGE, RP-HPLC和質(zhì)譜（MS）檢測其真實(shí)性。
十一、內(nèi)毒素對活性的影響
內(nèi)毒素（Endotoxin），是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物。當(dāng)細(xì)菌死亡自溶或粘附在其它細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)毒性，內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖中的類脂A成分。
內(nèi)毒素與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合引起免疫反應(yīng)，對細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用。我們的產(chǎn)品均采用多種方法有效去除內(nèi)毒素,使用鱟試劑（Limulus Amebocyte,LAL）測定含量小于0.1ng/ug (1 EU/ug)。
十二、貯存及復(fù)溶
產(chǎn)品均為無菌凍干粉劑，調(diào)整PH和鹽濃度經(jīng)0.2um過濾后分裝凍干。
請使用手動化霜冰箱，由于每次凍融都會造成蛋白的部分變性，所以要適量分裝盡量避免反復(fù)凍融。
干粉狀態(tài)在室溫下存放3周，不影響活性；放于-18℃以下，可穩(wěn)定保存至少一年。
復(fù)溶時(shí)依據(jù)說明書，大多數(shù)溶解在滅菌超純水（18MΩ.cm）中，濃度不低于100μg/ml，以待進(jìn)一步稀釋至工作濃度。蛋白質(zhì)在高濃度下穩(wěn)定，所以有些加入載體蛋白，但是可能會對實(shí)驗(yàn)造成影響。我們的產(chǎn)品均不含carrier protein或其他添加物（如BSA、HAS、蔗糖等），而是以低鹽的形式做凍干處理，微量的細(xì)胞因子在凍干過程中會沉積于管內(nèi)，形成很薄或不可見的蛋白層。所以使用前先離心20-30s，使附于管蓋或管壁的蛋白集于管底，有些產(chǎn)品復(fù)溶需要加入醋酸，因?yàn)楹琍BS的凍干粉中性時(shí)容易吸附管壁，加入酸溶于液體中，表面活性劑也防止吸附。
復(fù)溶后的細(xì)胞因子，4℃可穩(wěn)定儲存 2周；長期保存請分裝后存放于-20℃以下，可穩(wěn)定保存至少三個(gè)月。最好在-80℃保存。分裝時(shí)濃度要>100ng/ul，體積要>20ul。
十三、重組細(xì)胞因子的交叉活性
- 大多數(shù)人類細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞都有活性。
- 許多小鼠細(xì)胞因子對人類細(xì)胞也有活力表現(xiàn)，但是比相應(yīng)人類細(xì)胞因子活力低。
- 一些人類的細(xì)胞因子如IL-7在小鼠細(xì)胞中表現(xiàn)出比小鼠細(xì)胞因子更高的比活力。
- 干擾素、GM-CSF、IL-3 和IL-4 有物種特異性，對于非人類細(xì)胞幾乎沒有活性。
- 成纖維細(xì)胞生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子是高度保守的，在其它的動物細(xì)胞中也能表現(xiàn)很好的活性。
十四、細(xì)胞因子的應(yīng)用
- 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)
- 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
- 細(xì)胞治療
- 細(xì)胞調(diào)亡的研究
- 干細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增分化（ips）
- 細(xì)胞因子的功能性分析
- 體外生化分析
- 作為抗原，應(yīng)用于生產(chǎn)高質(zhì)量抗體
- 抗體分析中作為陽性對照
- ELISA和其他分析方法中作為標(biāo)準(zhǔn)品使用
- 蛋白-蛋白相互作用
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