過度能量飲食攝入是代謝綜合征(MetS) 發生的風險因素之一，能量攝入過多會改變男性生殖功能，導致精子發生異常，引發男性不育癥發病率的增加。腸道菌群在代謝紊亂中起著關鍵作用，腸道微生物群對精子發生異常有著重要影響。內蒙古大學張滕研究員團隊建立了代謝綜合征(MetS)綿羊模型，對睪丸標本、宿主代謝組和腸道微生物進行分析，結合糞便微生物群移植證實了腸道微生物群與精子發生異常之間的聯系，從而探討精子發生受損的腸-睪丸軸機制。
過量能量飲食引起的代謝紊亂導致精子發生障礙
本實驗設置正常飲食組（ND），中能量飲食組（MED）、高能量飲食組（HED），其中MED組和HED組體重顯著增加、胰島素抵抗、血清低密度脂蛋白和總膽固醇顯著升高，表明兩組動物具有代謝綜合征表型。睪丸切片H&E染色結果表明過量能量攝入誘導精子發生受損。10×scRNA測序分析表明，精子發生障礙是由于精原細胞(SPG)分化受阻所致。為了闡明代謝紊亂引起的精子發生障礙中生殖細胞分化的分子性質，使用ND、MED和HED組的生殖細胞，計算各細胞亞型百分比精原細胞（SPG）(ND: 3.8%， MED: 6.58%，HED: 14.28%)、早期精母細胞(ND: 7.86%, MED: 17.60%, HED: 22.99%)和晚期圓形精細胞(ND: 41.00%, MED: 16.12%, HED: 14.36%)在三組間具有統計學差異（圖1E-F）。與H&E染色結果相對應，MED和HED組生精細胞顯著降低，提示SPG分化中斷。采用GO分析探討MetS綿羊模型中SPG分化遲緩的機制，在ND與MED和ND與HED中生殖調控通路和代謝調控通路高度富集。
（圖1）
MetS模型中膽汁酸的急劇下降破壞維生素A的吸收
為了探討SPG 分化受阻是否與腸道代謝相關，對腸道內容物進行非靶向代謝組檢測分析。過量能量飲食足以引發代謝產物的改變，在兩個對比組中有250種共同的差異代謝物發生改變，它們主要富集在維生素消化吸收通路中(圖2B)。維生素消化吸收途徑中富含的差異代謝產物由三種脂溶性維生素和五種水溶性維生素組成(圖2C)。由于膽汁酸相關途徑也被富集，由此推測脂溶性維生素的吸收受膽汁酸水平影響。這三種脂溶性維生素為視黃醇、視黃素和α-生育酚（維生素E）。視黃醇和視黃素是維生素A的生物活性形式，它們在體內可以相互轉化，具有相同的功能。視黃素可能進一步氧化為視黃酸，但這是一個不可逆過程。而維生素E是一種抗氧化劑，能促進維生素A吸收。數據分析結果顯示，與ND組相比，MED和HED組中維生素E 的相對豐度降低（圖2Da），說明兩組中維生素A的吸收受到影響。而與ND組相比，MED和HED組中視黃醇相對豐度顯著增加，視黃素相對豐度顯著降低（圖2Db-c）。表明很少有視黃醇轉化為視黃素，而視黃醇沒有被吸收就可能流失了。此外，甘膽酸的相對豐度沒有發生變化，而膽酸(CA)、石膽酸(LCA)和?；撬崛パ跄懰?TUDCA)相對豐度顯著降低(圖2Dd-g)。綜上，代謝組學結果提示在MetS模型中膽汁酸水平的降低會影響維生素A的吸收。
（圖2）
MetS模型誘導腸道菌群失調
對腸道內容物進行16S rDNA測序，與ND組相比，MED組和HED組29個細菌在屬水平上發生了改變，其中Ruminococcus_2 和 Ruminococcaceae_NK4A214_group 的相對豐度以能量劑量依賴性方式顯著降低。膽汁酸可以促進脂溶性維生素A的吸收， Pearsons相關分析發現CA、LCA和TUDCA與視黃醇和視黃素相關（圖3），Spearman分析發現Ruminococcaceae_NK4A214_group與CA、LCA和TUDCA存在顯著相關, 推測Ruminococcaceae_NK4A214_group顯著下調，進而對MetS模型中膽汁酸水平產生影響，從而影響宿主維生素A吸收。
（圖3）
MetS模型中維生素A代謝紊亂通過血液循環轉移到宿主睪丸
為了研究精子發生異常的機制，采用LC-MS靶向代謝組學分析不同處理組睪丸樣本中維生素A水平，與ND組相比，HED組維生素A水平顯著降低，血清中維生素A水平變化趨勢一致。睪丸細胞從血液中吸收維生素A，血清維生素A與視黃醇結合蛋白4（RBP4）結合，維生素A通過RBP4輸送進入睪丸細胞。采用免疫熒光(IF)染色和Western blot檢測RBP4表達水平，與ND組相比，MED和HED組RBP4表達水平顯著降低（圖4C）。這與睪丸組織和血清中維生素A水平變化一致。此外，檢測了減數分裂前細線期精母細胞（pre-L-SPC）標記基因的表達(圖4D-F)，發現pre-L-SPC階段STRA8和SYCP3表達水平顯著下降。在本研究中，精子發生過程損傷是由減數分裂基因標記表達下調引起，維生素A代謝在減數分裂基因激活中起著至關重要的作用。使用IF染色和Western blot檢測睪丸中RDH10表達水平，發現與ND組相比，RDH10在MED和HED組中下調。綜上，表明維生素A和RDH10水平的降低導致MetS模型中睪丸精子發生受損。
（圖4）
維生素A代謝紊亂導致精子形成受損依賴于腸道菌群
為研究腸道微生物群對MetS模型中精子發生受損表型的影響，將ND組和HED組的腸道內容物通過灌胃方式移植到小鼠體內，定植8周后與ND-FMT組小鼠相比，HED-FMT組小鼠睪丸維生素A水平顯著降低（圖5B）。與ND組相比，HED組和HED-FMT組的Ruminococcaceae_NK4A214_group的豐度顯著降低。H&E 染色檢查睪丸形態，發現移植了ND微生物群的小鼠睪丸發育正常，而移植了HED組菌群的小鼠睪丸組織表現出生精上皮變薄和睪丸細胞從生精小管基底膜上脫落，且部分生精細胞死亡并脫落到小管腔中（圖5D）。通過IF染色和Western blot(圖5F-H)檢測STRA8和RDH10的表達水平，發現HED-FMT蛋白表達明顯下降，與MetS結果相似。綜上結果表明，菌群移植受體小鼠重現了代謝紊亂模型中觀察到的微生物和代謝表型，腸道微生物群介導了維生素A代謝紊亂，導致精子發生破壞。
（圖5）
小結
代謝綜合征中男性不育通常伴有腸道微生物菌群失調，因此，腸-睪丸軸在代謝綜合征男性不育的病因學中值得深入探討。本文對過度能量飲食誘導的MetS模型中精子發生受損進行了詳細的表型評估，發現異常小管的數量顯著增加，SPG分化急劇下降。在MetS模型中觀察到腸道對維生素A吸收受到破壞，主要是由于在MetS模型中腸道微生物群的不平衡導致膽汁酸豐度顯著減少，脂溶性維生素的吸收受到膽汁酸水平降低的影響，維生素A的代謝異常通過循環血液轉移到睪丸細胞，導致精子發生受損。通過糞便微生物群移植實驗證實異常的維生素A代謝依賴于腸道微生物群，從而導致精子發生受損。本研究揭示了維生素A在腸道-睪丸軸代謝中的關鍵作用，通過恢復維生素A代謝相關的腸道菌群將對MetS引起的男性不育患者的治療具有潛在價值。
（圖6）
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參考文獻
Zhang T, Peng S, et al. Disrupted spermatogenesis in a metabolic syndrome model: the role of vitamin A metabolism in the gut–testis axis. Gut. 2022.
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