上期我們解析了Cas蛋白家族的十八般武藝，其作為基因編輯的“剪刀”，在CRISPR系統中發揮著至關重要的作用。但Cas蛋白并不能單獨完成精準的基因編輯任務，它需要一個精準定位的“導航系統”——向導sgRNA，來引領它到達基因組中的特定位置。本期我們將聚焦于sgRNA，對其進行詳細解讀，幫助各位科研伙伴精通、運用CRISPR/Cas9技術。
sgRNA（single guide RNA，小向導RNA），是基因編輯技術中的關鍵分子，由 crRNA（與目標DNA互補的CRISPR RNA）和tracrRNA（激活Cas9蛋白的反式激活crRNA）連接而成。
sgRNA組合圖
sgRNA的前身源于2007年，法國科學家Rodolphe Barrangou等人在研究嗜熱鏈球菌的過程中，發現當噬菌體感染嗜熱鏈球菌后，嗜熱鏈球菌會將噬菌體的DNA片段整合到其自身的CRISPR序列中，形成新的間隔序列。再次遭受同一種噬菌體的侵襲時，其CRISPR序列中的間隔序列會被轉錄成crRNA，crRNA與tracrRNA結合形成復合物，引導Cas9蛋白識別并切割噬菌體的DNA，從而使嗜熱鏈球菌獲得對該種噬菌體的免疫[1]。這一發現不僅首次證實了CRISPR-Cas系統在細菌中是一種獲得性免疫機制，能夠幫助細菌抵御外來病毒的侵害，也為后來sgRNA的設計打下了基礎。
隨后科學家們陸續鑒定出多種細菌和古細菌中的tracrRNA（反式編碼的小RNA），適配不同的CRISPR系統。其中，最簡單的系統是來自化膿性鏈球菌（S. pyogenes）的II 型 CRISPR 系統。最終，Jennifer與Emmanuelle根據crRNA和tracrRNA的雙RNA結構引導Cas9蛋白定位特定位點的原理，設計將crRNA的3’端與tracrRNA的5’端融合成具有發夾結構的sgRNA，其證明，僅需設計crRNA 5’端20nt的氨基酸序列，與靶DNA結合，再通過tracrRNA激活Cas9蛋白，即可引導Cas9蛋白實現高效、精準的切割，構建了CRISPR/Cas9基因編輯系統[2]。
CRISPR/Cas9技術原理
設計sgRNA
要想進行CRISPR/Cas9基因編輯，sgRNA的設計是必不可少的。首先，需要確認靶DNA序列，即切割位點前存在特定的PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）——對常用的SpCas9蛋白而言，PAM為5'-NGG-3'（位于靶點下游3bp）。之后根據目標物種的編輯需求（基因敲除/敲入/堿基編輯），選擇合適的Cas蛋白，如野生型SpCas9蛋白（Cat.No.:E365）、小體積SaCas9（Cat.No.:E372）等。
設計原則
1：sgRNA的長度：S. pyogenes II型CRISPR系統（SpCas 9）一般為20nt（靶基因匹配序列）。
2：sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA模板序列為位于PAM序列前，PAM序列的特征為NGG（N可以為任意核苷酸），所以選擇3’末端含有GG的sgRNA，這樣可以構成PAM序列。同時，sgRNA的序列應避免以4個以上的T結尾，GC%含量最佳為30%-70%（40%-60%）。
3：sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數都應盡可能的高，一般大于60，認為是可用的。
4：如果構建U6啟動子或T7啟動子驅動sgRNA的表達載體，需要考慮sgRNA的5’堿基為G或GG，來提高其轉錄效率。
5：全基因的脫靶效應分析，需要考慮脫靶位點的錯配堿基數，最多不超過5個。
6：如果想要造成基因移碼突變，需要盡量靠近基因編碼區的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子上。
體外轉錄合成sgRNA
sgRNA設計完成后，即獲得正向引物和反向引物，以DNA為模板，通過上下游引物互補配對擴增出雙鏈DNA，再以雙鏈DNA為模板，通過T7 RNA聚合酶或其他RNA聚合酶，體外轉錄合成sgRNA。之后通過DNaes I消化產物中的雙鏈DNA模板，再通過純化試劑盒獲得純化的sgRNA。
體外轉錄合成sgRNA步驟
體外轉錄合成 sgRNA 具有諸多優勢，如在基因編輯實驗中，尤其是對于受精卵等需要快速起效的場景，可提前制備好sgRNA，使基因編輯盡早進行，提高實驗效率。相比在細胞內表達sgRNA的方式，體外合成的sgRNA更能精確控制其濃度和質量，從而優化基因編輯的效果，減少不必要的副反應。此外，該方法適用于多種細胞類型，且合成過程相對靈活可控，可根據具體實驗需求進行調整。
市面上已經有很多體外轉錄試劑盒，但存在操作步驟繁瑣、sgRNA產量低等問題。近岸蛋白新推出的產品，通用型一步法sgRNA體外轉錄試劑盒（Universal sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit，Cat.No.:E399），能夠一步體外高效轉錄sgRNA片段，除可合成常見的Cas9 sgRNA以外，還可合成其他具有更高基因組編輯效率和更低脫靶率的Cas蛋白sgRNA（如：Cas12a、Cas12b、Cas13a等），20μl體系sgRNA產量可達10-30μg，適配不同種類的sgRNA，高效助力基因編輯！
通用型sgRNA體外轉錄實驗流程
需注意，不同Cas蛋白的引物設計原理不同，需根據選擇的Cas蛋白調整引物的序列。
性能展示
適配多類型Cas蛋白的sgRNA，告別“換酶即換盒”
圖例）體外轉錄不同類型Cas酶的sgRNA。結果顯示，E399試劑盒適配多種類型Cas蛋白，轉錄效率高，產量高。
一步高效合成，效率與產量雙贏
圖例）E399體外高效轉錄sgRNA，擴增的sgRNA的濃度及產量均高于其他產品。
在CRISPR-Cas9系統中，Cas蛋白是切割DNA的分子剪刀，而sgRNA則是精準制導的導航系統。只有sgRNA與Cas蛋白相互協作，才能實現對目標基因的精準編輯。那么sgRNA和Cas蛋白兩個核心組件已經整裝待發，是時候進入細胞啟動基因編輯，下期近岸蛋白將詳細解析CRISPR/Cas系統運送到細胞的各種轉染技術，下期不見不散！
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參考文獻
[1]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes [J]. Science, 2007, 315 (5819): 1709-1712.
[2]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I M, et al. A programmable dual - RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science, 2012, 337(6096): 816 - 821.