終末期腎?。‥SRD）是慢性腎臟疾?。–KD）的晚期階段，其發生發展與血液中毒性代謝物的積累密切相關。其中許多是源于腸道菌群的毒素，且難以通過透析有效清除。已有研究報道CKD患者腸道菌群結構存在顯著改變，ESRD患者血液透析后血液和糞便代謝失調，提示CKD中存在腸道菌群介導的代謝失調，但ESRD相關代謝產物（如尿毒癥毒素）的微生物起源以及菌群介導的ESRD代謝變化的機制尚未得到充分研究。中國農業大學任發政院士和于政權教授及其團隊對223例ESRD患者和69例匹配的健康對照進行了多組學分析并用無菌動物實驗驗證了腸道菌群對毒素累積和疾病表型的影響，揭示了患者腸道菌群失調與代謝紊亂和腎病臨床表型之間的關系，相關研究成果發表于《Gut》。
ESRD患者血清與糞便代謝組分析
采用非靶向代謝組學技術對223例ESRD患者及其匹配的69例健康對照的血清樣本進行分析，共鑒定出180種代謝物，其中134種具有顯著差異。將患者按照原發疾病類型分為三個亞組：腎小球腎炎(n=76)、糖尿病腎病(n=73)和其他(n=74)，并分別與對照組進行比較，結果顯示三種情況下的差異代謝物較為相似。而ESRD是造成差異的主要原因，因為它解釋了接近11%的變異，其他生物臨床變量（如性別、體重和總血液膽固醇濃度）共同解釋了額外的8.5%（圖1B）。
ESRD血清代謝譜的主要特征是9種尿毒癥毒素富集和膽汁酸組成失衡（即結合型 vs 非結合型膽汁酸、初級 vs 次級膽汁酸（SBAs））（圖1C）。隨后研究人員對隨機選擇的40例ESRD患者和20例健康對照血清中差異代謝物進行定量分析并驗證了ESRD患者尿毒癥毒素的積累。據報道，除了由細菌分解膽堿和肉堿而產生的氧化三甲胺（TMAO），這些毒素主要是由腸道菌群降解飲食中的芳香族氨基酸（AAAs）和多酚而產生。血清代謝物聚類后與臨床變量進行相關分析結果顯示，尿毒癥毒素和膽汁酸在內的簇與相關臨床變量（如血肌酐和腎小球濾過率）密切相關，表明這些代謝物的變化對患者的臨床生理狀態的重要性。
糞便代謝組學分析共鑒定出225種代謝物，其中98種在兩組中具有顯著差異。患者糞便中尿毒癥毒素前體和SBAs呈現富集，而初級BAs、短鏈脂肪酸（SCFAs）及其衍生物（如甲基丁酸和甲基丙酸）顯著降低，這些代謝物解釋了糞便代謝組變化的49.6％。Procrustes分析發現血清和糞便代謝譜具有很強的協同作用（圖1F），ESRD患者腸道代謝改變促進了血清尿毒癥毒素的積累。進一步納入包括12例ESRD患者和12名健康對照的獨立隊列，證實了ESRD患者血清尿毒癥毒素的積累，同時患者糞便中毒素前體的升高也伴隨著SCFAs及其衍生物明顯降低的趨勢。
圖1 ESRD患者相關的血清和糞便代謝組學分析
ESRD患者微生物組成和功能特征
研究人員對糞便樣本進行宏基因組分析，結果顯示，相較于健康對照組，ESRD患者的Eggerthella lenta, Flavonifractor plautii、Alistipes finegoldii、A. shahii、Ruminococcus spp和Fusobacterium spp顯著富集，而Prevotella copri、Clostridium spp和幾種產丁酸的菌減少（圖2B）。ESRD患者糞便中SCFAs的減少可能是由產SCFA的菌豐度降低所致，并且氨基酸生物合成降低而分解提高可能反映了ESRD患者的氨基酸利用率增加。另外，參與AAA降解和SBA生物合成的功能模塊在ESRD患者中顯著富集，與糞便代謝組中發現的尿毒癥毒素和SBA累積一致。因此，ESRD患者中尿毒癥毒素的富集與腸道菌群介導的AAA降解和微生物SBA生物合成有關。
圖2 ESRD患者腸道菌群特征及其與血清和糞便代謝物的關系
腸道菌群與代謝物關聯分析
研究人員對腸道MGSs豐度、血清和糞便代謝物進行相關分析，發現在ESRD患者和健康對照組中三者之間均存在緊密聯系（圖3A, 3B）。其中尿毒癥毒素和膽汁酸占ESRD患者血清代謝物相關性的95.0%，遠遠超過對照組的69.3%，ESRD患者中血清尿毒癥毒素和膽汁酸同時受腸道菌群和糞便代謝物的顯著影響（圖3C）。此外，腸道菌群對ESRD患者代謝譜的影響是可觀的，分別占血清和糞便31.3%和39.0%（圖3D）。因此，除了腎功能外，腸道微生物似乎是宿主糞便和血清代謝譜的重要決定因素。
圖3 ESRD患者腸道菌群影響宿主血清和糞便代謝譜
ESRD相關菌群促進患者體內毒素的積累并與疾病的臨床特征有關
為進一步證實腸道菌群在尿毒癥毒素和SBA產生中的潛在作用，研究人員對編碼這些化合物主要合成途徑中至關重要酶的微生物基因進行了分析，共確定5134個編碼6種主要尿毒癥毒素和SBA關鍵合成酶的基因，這些基因在ESRD患者及其富集的腸道微生物中更為豐富，糞便中代謝物的濃度與同源合成酶編碼基因的豐度呈正相關。利用隨機森林模型確定每種毒素或SBA與含有毒素/SBA合成酶編碼基因的物種豐度之間的相關性，鑒定出83個顯著相關的菌種（圖4）。這些模型平均解釋了26%的血清和糞便代謝物變異，提示這些菌種主要貢獻毒素和SBA的產生。尿毒癥毒素或SBA產生相關的微生物基因與最重要的ESRD臨床變量顯著相關，尤其是eGFR、肌酐、尿素、C反應蛋白和血紅蛋白的水平與微生物物種豐度顯著相關。因此腸道微生物組成可通過尿毒癥毒素和SBA的累積加劇ESRD癥狀。
圖4 尿毒癥毒素/SBAS和MGSs的網絡聯系
腸道菌群的改變影響毒素的累積并加劇腎病惡化
為了驗證腸道菌群通過毒性代謝物來驅動腎衰竭的假說，研究人員進行了糞菌移植實驗。結果顯示，與對照組的受體小鼠相比，移植ESRD患者菌群的小鼠表現出更嚴重的腎纖維化、腎小球硬化和氧化應激，以及血清尿素和肌酐水平的升高（圖5B, 5C），并且血清中幾種尿毒癥毒素（包括硫酸對甲酚、苯乙酰甘氨酸、硫酸苯基和硫酸吲哚）水平顯著升高（圖5D）。為了驗證特定的菌種是否能夠通過產生尿毒癥毒素來促進腎病進展，作者又選擇了兩種菌進行了單菌移植實驗，其中E. lenta是ESRD患者中富集程度最高的微生物物種之一，可將多酚降解為苯甲酸或4-羥基苯甲酸，與馬尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和SBA等多種毒素的產生有關。F. nucleatum參與吲哚和苯酚等物質的產生，并且此菌在大腸癌中被認為是一種促炎性細菌。結果表明單菌移植對整體腸道菌組成無顯著影響，但血清尿毒癥毒素水平顯著升高，同時腎纖維化、腎小球硬化和氧化應激加劇，以及血清尿素和肌酐水平升高。因此，ESRD患者腸道菌群產生的尿毒癥毒素可加劇腎病的惡化。
最后，研究人員對CKD大鼠進行Bifidobacterium animalis A6灌胃，發現盡管微生物總體組成未發生顯著變化，但E. lenta和Fusobacterium spp豐度顯著降低，并且血清尿毒癥毒素、肌酐、尿素濃度明顯降低，腎纖維化和腎小球硬化減輕，表明益生菌菌株可通過調節產毒素的細菌豐度來減輕大鼠腎臟疾病。
圖5 動物實驗驗證ESRD菌群及Eggerthella lenta 和Fusobacterium nucleatum產血清尿毒癥毒素和加重腎病的作用
小結
本研究通過血液代謝組、糞便代謝組與微生物組分析逐步揭示了ESRD患者腸道菌群改變是導致其糞便和血液代謝失調的重要原因，發現ESRD患者血清尿毒癥毒素和SBA的累積與腸道菌群介導的AAA降解和SBA合成的增加有關，進一步利用動物模型闡明了腸道細菌通過毒性代謝物影響腎病的機制，提示調節腸道菌群有望成為降低患者尿毒癥毒素的靶點，為ESRD的輔助治療提供了新的思路和理論支持。
圖6 腸道菌群的改變引起ESRD加重的機制
參考文獻
Wang X, et al. Aberrant gut microbiota alters host metabolome and impacts renal failure in humans and rodents. Gut 2020. doi:10.1136/gutjnl-2019-319766.
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