對(duì)人類(lèi)的流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究以及對(duì)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究表明，最常見(jiàn)的慢性非傳染性疾病（如缺血性心臟病（IHD））的發(fā)病機(jī)制一般涉及多因素的復(fù)雜相互作用，而迄今為止的大部分研究往往忽視了這一點(diǎn)。來(lái)自丹麥哥本哈根大學(xué)Oluf Pedersen等團(tuán)隊(duì)在IHD的既往研究背景下，通過(guò)對(duì)處于心臟代謝疾病(CMD)譜系中不同階段的中年人進(jìn)行腸道宏基因組和血清和尿液代謝組的綜合分析，獲得疾病進(jìn)程中的菌群和代謝組的變化特征。相關(guān)成果發(fā)表于《Nature Medicine》。
研究設(shè)計(jì)和表型分析
本研究招募1241 名歐洲中年人，包括372 名IHD患者，其中 112 名患有急性冠狀動(dòng)脈綜合征 (ACS)、158 名患有慢性缺血性心臟病 (CIHD) 和 102 名伴有心力衰竭 (HF)的 IHD；此外還包括275 名在人口統(tǒng)計(jì)、年齡和性別方面匹配的健康對(duì)照 (HC)和222 名未經(jīng)治療的代謝匹配對(duì)照 (UMMC)（即具有代謝綜合征特征的個(gè)體，IHD風(fēng)險(xiǎn)增加但未接受脂質(zhì)-降低或抗糖尿病或抗高血壓藥物）。最后納入372 名與IHD患者在T2D狀態(tài)和體重指數(shù) (BMI) 方面匹配的對(duì)照——代謝匹配對(duì)照 (MMC)（圖1）。
結(jié)果顯示，CMD 表型嚴(yán)重程度和相關(guān)藥物攝入量從HC到經(jīng)過(guò)治療和未治療的代謝匹配對(duì)照（分別為MMC和 UMMC）再到明顯IHD病例的進(jìn)展過(guò)程中不斷增加。盡管?chē)?guó)籍、年齡、性別、BMI和T2D狀態(tài)相匹配，但I(xiàn)HD患者的表型仍然與MMC個(gè)體明顯不同：IHD組表現(xiàn)出內(nèi)臟脂肪增加、血糖升高、肝酶血漿濃度升高以及高血壓患病率和嚴(yán)重程度增加。同時(shí)，不同研究組的飲食和身體活動(dòng)存在差異。與IHD和MMC組相比，HC組的飲食更健康并且且體力活動(dòng)水平也更高。
圖1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程
與代謝紊亂相關(guān)的菌群和代謝組變化
腸道菌群的分類(lèi)和功能以及代謝物在IHD和HC個(gè)體之間存在顯著差異。與HCs與IHD兩組間差異相比，HC與MMC顯示出更多的差異特征（圖2a）。此外，IHD 和HC組之間菌群和代謝物特征的區(qū)分潛力顯著高于IHD和MMC個(gè)體之間的差異（圖2b）。HC和IHD之間的結(jié)果與既往報(bào)道的IHD相關(guān)的腸道菌群研究結(jié)果一致。然而，大多數(shù)特征在MMC與HC比較中已經(jīng)呈現(xiàn)顯著差異，表明以前的研究可能錯(cuò)誤地將代謝障礙特征報(bào)告為真正的IHD特征，這可能會(huì)增加IHD的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檫@些特征不是IHD特有的。
在較高的菌群結(jié)構(gòu)水平下，隨著疾病的惡化，從擬桿菌屬1和瘤胃球菌屬菌群向較低細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的擬桿菌屬2發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變（圖2c），反映從MMC和IHD到HC個(gè)體中菌群基因豐富度（圖2d）和菌群負(fù)荷的顯著降低。相比之下，IHD組與MMC組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。在UMMCs中的菌群基因豐富度降低和擬桿菌屬2的增加甚至更加嚴(yán)重，這可能是由于尚未使用藥物以及該組中存在更肥胖的表型。
圖2. IHD發(fā)展中腸道菌群和代謝特征變化
IHD的菌群和代謝組特征
根據(jù)CMD譜中的各個(gè)組比較中的特征對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，從而進(jìn)一步區(qū)分 IHD 特征與其代謝發(fā)病率，定性地關(guān)注條件特異性，定量地關(guān)注效應(yīng)大小（圖3）。通過(guò)僅在相應(yīng)條件下表現(xiàn)出的顯著變化（即HC與MMC/ UMMC 的代謝異常特征（DMF）或MMC/UMMC 與IHD患者的IHD特異性特征 (IHDF)）來(lái)確定代謝異常（圖3a，b）或IHD（圖3a，c）。此外，根據(jù)它們是否在代謝異常和IHD中表現(xiàn)出典型的效應(yīng)大小變化來(lái)識(shí)別特征，或者將其保持在從代謝異常到IHD的相同方向（升級(jí)特征(ESCF))或者保持在相反方向（降級(jí)特征（DSCF））進(jìn)行識(shí)別（圖3）。
ESCF是IHD的早期特征，在代謝發(fā)病率（即HC與MMC/UMMC）到顯性IHD（即MMC/UMMC與IHD組）期間ESCF出現(xiàn)持續(xù)增加/較少；相比之下，當(dāng)考慮HC與MMC/UMMC和MMC/UMMC 與IHD之間的效應(yīng)大小時(shí)，DSCF 表現(xiàn)出相反的轉(zhuǎn)變模式。總之，對(duì)于MMC中已經(jīng)異常的特征，DSCF代表那些在診斷和治療的IHD中恢復(fù)到HC水平的特征，可能與疾病穩(wěn)定有關(guān)。IHD相關(guān)特征被歸類(lèi)為一般代謝異常的特征，而非IHD特有的特征，其次是IHD特有特征，然后是降級(jí)和升級(jí)特征。
圖3. 橫斷面研究中用于菌群和代謝特征分類(lèi)的方法
在121種作為代謝異常標(biāo)志物的物種（DMF）中，絕大多數(shù)（85%）在IHD中被消耗，IHD特異性特征有23個(gè)物種（圖4a和5），在患者中具有相似的消耗趨勢(shì)（65%），包括之前報(bào)道的在IHD中消耗的三種變形菌（Acinetobacter、Turcimonas 和 Acetobacter）。在IHD組富集的8個(gè)物種中，有2個(gè)是Burkholderiales目的Betaproteobacteria菌，而已報(bào)道Burkolderia pseudomallei是心內(nèi)膜炎的一個(gè)可能原因。Ruminococcus（在IHD中消耗的未被鑒定的一個(gè)單一物種）是IHD的升級(jí)標(biāo)記（圖4b）；ruminococci包括丁酸生成者，其消耗可能導(dǎo)致IHD中短鏈脂肪酸 (SCFA) 的生成潛力降低。6個(gè)物種是IHD的降級(jí)特征（圖4c），它們屬于Clostridiales目，除了Eubacterium siraeum之外，其他的都沒(méi)有在物種甚至屬分類(lèi)水平上分類(lèi)。據(jù)報(bào)道Eubacterium在動(dòng)脈粥樣硬化中被消耗。相比之下，菌群功能（GMMS）和KEGG模塊大多富集在在IHD中。
在代謝物方面，大多數(shù)IHD特異性特征代謝物被顯著富集：相對(duì)于HC，在203個(gè)IHD特異性特征中，只有50個(gè)（25%）被消耗（圖4）。還發(fā)現(xiàn)一系列IHD特異性代謝物的富集，包括膽堿和肉堿途徑的中間體（即膽堿、甜菜堿醛、三甲胺氮氧化物（TMAO）等物質(zhì)的前體），已知可調(diào)節(jié)IHD風(fēng)險(xiǎn)。還發(fā)現(xiàn)花生四烯酸 (C20:4) 來(lái)源的促炎脂質(zhì)（5-羥基二十碳四烯酸（5-HETE）、白三烯B4等）升高。相比之下，脂肪酸甲酯（十六烷酸甲酯、亞麻酸甲酯和油酸甲酯以及α-生育酚）是最主要的一類(lèi)代謝物，其消耗構(gòu)成IHD的特異性標(biāo)記（圖4a）。
代謝組所代表的大多數(shù)IHD升級(jí)特征在代謝異常時(shí)表現(xiàn)出最初消耗，在IHD診斷后持續(xù)消耗（圖4b）。除了包括鞘磷脂和甘油磷脂在內(nèi)的幾種復(fù)雜磷脂外，已知能改善心血管健康的幾種類(lèi)胡蘿卜素(例如胡蘿卜素二醇和β-隱黃質(zhì))和**硫素，也表現(xiàn)出上述消耗模式。相比之下，4-甲酚和苯乙酰谷氨酰胺表現(xiàn)出從代謝異常到IHD的富集模式（圖4b）。上述代謝物是早期干預(yù)的關(guān)鍵目標(biāo)，尤其是 4-甲酚，在本研究中作為ACS和 CIHD 升級(jí)特征出現(xiàn)，它也是HF患者血液中特異性富集的最重要的標(biāo)志物之一，可能與其在尿毒癥中的作用有關(guān)。
大多數(shù)DSCF（代謝物和菌群功能分別為 89% 和 100%）在代謝障礙階段表現(xiàn)出初始消耗模式，但在IHD治療階段表現(xiàn)出明顯逆轉(zhuǎn)（圖4c）。表明菌群和代謝物特征對(duì)長(zhǎng)期多因素治療的反應(yīng)，可能有助于IHD的穩(wěn)定。此外，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的IHD狀態(tài)似乎涉及恢復(fù)損失的腸道菌群細(xì)胞密度（圖4c），以及降解支鏈氨基酸和半乳糖的能力，同時(shí)恢復(fù)損失的丁酸和乙酸生產(chǎn)能力。
圖4. 與IHD及其代謝障礙階段的菌群和代謝特征
IHD 亞型的菌群和代謝組特征
對(duì)ACS、CIHD和HF組的綜合分析為菌群和代謝物特征的相對(duì)變化提供了更多理解：與對(duì)照組相比，每個(gè)IHD亞組的典型特征總數(shù)在CIHD中最高，其次是HF和ACS。CIHD在腸道菌群功能上表現(xiàn)出最大的差異變化，而ACS在代謝物特征上表現(xiàn)出主要的差異變化（圖 5）。通過(guò)IHD與HC比較發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)（69%）與代謝障礙相關(guān)的物種也存在于IHD亞組與HC比較中，這表明似乎與代謝功能障礙有關(guān)的菌群紊亂可能在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)存在于IHD的各個(gè)階段。
在考慮ACS特有的代謝特征時(shí)，前10個(gè)代謝物中有8個(gè)是藥物分析物或藥物代謝物，與阿司匹林、美托洛爾和阿托伐他汀有關(guān)。促炎代謝物（5-和12-羥基二十碳四烯酸 (HETE)、白三烯B4和B5）以及菌群宿主苯丙氨酸共代謝產(chǎn)物（苯乙酰肉堿、苯乙酰谷氨酸和 2-羥基苯乙酸）也有所增加，其次是吲哚硫酸和 TMA，與已確定的IHD的總體特異性特征一致。同樣，一些ACS特異性消耗代謝物在IHD中的含量也較低，包括α-生育酚、油酸甲酯和十六烷酸甲酯。
與ACS的發(fā)現(xiàn)相反，CIHD和HF分別發(fā)現(xiàn)了19個(gè)和31個(gè)特異物種標(biāo)志物，表明IHD慢性期的菌群發(fā)生了其他的變化，且這些變化影響的菌屬種類(lèi)不多。大多數(shù)CIHD特異性特征在對(duì)照組中富集，尤其是氨基酸生物合成的菌群功能顯著富集，包括BCAA、蛋氨酸和賴(lài)氨酸模塊。苯乙酸代謝物的升高反映了苯丙氨酸和酪氨酸的降解的增強(qiáng)。
一些代謝物特征表現(xiàn)出HF特異性富集，包括4-甲酚、4-甲酚硫酸、4-甲酚葡糖苷酸、膽堿和TMA以及幾種肉堿；相反，一些代謝物在HF特異性消耗，如α-生育酚和3-吲哚乙醛酸，提示脂肪酸代謝改變，已報(bào)道脂肪酸代謝在HF發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
圖5. IHD及其亞型中的代謝和菌群特征發(fā)生獨(dú)特變化
臨床亞組分類(lèi)
通過(guò)將MetaCardis研究人群隨機(jī)分成70%和30%的組構(gòu)建模型，前者用于訓(xùn)練，后者用于測(cè)試；在所有病例中，組學(xué)標(biāo)志物在測(cè)試集上產(chǎn)生曲線下面積（AUC）值均大于0.7，并且高于僅臨床標(biāo)志物的AUC值，尤其是相對(duì)于MMC組的分類(lèi)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證分類(lèi)模型，利用了另一獨(dú)立數(shù)據(jù)集，重點(diǎn)關(guān)注的ACS亞組以匹配研究樣本的病理。來(lái)自?xún)身?xiàng)研究的ACS特異性代謝組學(xué)標(biāo)志物高度相關(guān)（圖6a），證實(shí)在兩項(xiàng)研究中觀察到類(lèi)似的變化并驗(yàn)證了大部分的ACS特異性代謝物特征。而且，當(dāng)上述標(biāo)志物用于在人群中訓(xùn)練并在獨(dú)立的另一人群中測(cè)試的 OPLS-DA模型中時(shí)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的區(qū)分潛力。基于具有臨床變量（模型3）或沒(méi)有臨床變量（模型2）的ACS特異性組學(xué)標(biāo)志物的模型的性能明顯優(yōu)于僅基于臨床的模型（圖6c）。總之，本研究證實(shí)了的校正混雜因素后的菌群和代謝組標(biāo)志物在臨床環(huán)境中的鑒別潛力的穩(wěn)健性（圖6）。
圖6. ACS標(biāo)志物的驗(yàn)證
小結(jié)
本研究對(duì)健康個(gè)體、代謝異常疾病個(gè)體和處于三個(gè)不同臨床階段的IHD個(gè)體進(jìn)行橫斷面研究，獲取心臟代謝疾病的廣泛腸道菌群和血漿和尿液代謝組特征。通過(guò)對(duì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，調(diào)整了多種藥物的混雜因素以及在診斷IHD前的前驅(qū)期發(fā)生的代謝異常的影響。此外，本研究還對(duì)與IHD及其亞型代謝異常或升級(jí)、降級(jí)或穩(wěn)定相關(guān)的菌群和代謝組病理生理特征進(jìn)行了分類(lèi)。
參考文獻(xiàn)
Microbiome and metabolome features of the cardiometabolic disease spectrum. Nature Medicine. 2022. https://doi.org/10.1038/s41591-022-01688-4.
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