磷(Pi)限制是制約作物生產的主要因素。為了更好地應對缺磷的壓力，植物在吸收和利用磷方面已經進化出多種適應機制，包括對磷的改變生長和磷饑餓信號的激活。然而，這些策略是如何協調的，目前的研究依然十分有限。

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2022年5月30日，中國農業科學院 易可可課題組在PLANT CELL上發表了名為Alternative splicing of REGULATOR OF LEAF INCLINATION 1 modulates phosphate starvation signaling and growth in plants的研究成果。

之前的研究表明，水稻的RLI1、GOLDEN2、ARR-B和Psr1 (GARP)亞家族轉錄因子可以調控葉片傾角，以應對不同的磷元素供應量?；蚪M注釋和公開的RNA測序數據表明，RLI1有兩種不同的轉錄變異。RT-PCR 和 WB結果表明RLI1有兩個轉錄變異體，可以在水稻中產生RLI1a和RLI1b亞型。 該研究發現在磷缺乏條件下RLI1a的轉錄被大幅度抑制，而RLI1b受到的影響較小(圖1A)。 在磷缺乏條件下RLI1a蛋白水平顯著低于磷充足條件下 (圖1,B和C)。然而，RLI1b蛋白水平在磷缺乏條件下顯著提升，這些結果表明磷供給不足可能導致RLI1b表達上調。

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圖1 A, qRT-PCR分析RLI1a和RLI1b在野生型植物中的表達水平，在+ P (200 μM Pi)和-P (0 μM Pi)條件下生長。在+ P條件下生長10天的植株被轉移到+ P和-P條件下再生長10天。

B，免疫印跡分析+ P和-P條件下野生型植物RLI1a和RLI1b蛋白水平。

C，圖(B)中相對蛋白的定量水平;

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考慮到RLI1a和RLI1b對缺磷脅迫的反應不同，以及RLI1(本研究中RLI1a)在葉片傾角中對外部磷利用能力的應激能力，我們假設RLI1a和RLI1b可能在調節葉片傾角方面發揮不同的作用。

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因此，該研究在RLI1a- ox和RLI1b- ox兩種植物的縱向切片上測量了葉片節理細胞長度。RLI1a- ox -3的細胞長度顯著大于其他植物，而RLI1b- ox -1和WT之間沒有顯著差異(圖2,E和F)。這些結果表明，與RLI1a不同，RLI1b不影響葉片節理細胞長度來調節葉片傾角(圖2,E和F)。在-P條件下，rli1b - ox植株的葉片傾角也與WT相當。這些結果表明，PSI葉片直立性的產生與RLI1a的抑制有關，而與RLI1b的抑制無關。

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圖2 E, WT、rli1、RLI1a-Ox-3、RLI1b-Ox-1植株第2葉頂葉層節縱向剖面圖。比例尺，50 μm。F，葉片節理細胞長度。值表示平均值±SD (n = 30-50)。

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水稻RLI1b-Ox品系表現為葉尖壞死，是磷中毒的典型癥狀。出乎意料的是，RLI1a-Ox也顯示葉尖壞死(圖3A和圖4A)。通過對這些過表達系中磷含量的測量，證實了在磷充足條件下，RLI1a-Ox和RLI1b-Ox植株的地上部磷積累高于野生型，而在磷匱乏條件下這些差異顯著緩減小(圖4,B和C)。這些結果表明，RLI1a和RLI1b在水稻中都具有調控磷積累和調節磷匱乏信號的功能。

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圖3 A水培條件下WT、RLI1a過表達系(A - ox -3/7/10)和RLI1b過表達系(b-Ox-1/9/12)的表型表現分析。

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圖4A, WT與RLI1a過表達株系(A - ox -3/7/10)和RLI1b過表達株系(b-Ox-1/9/12)葉片的表型表現。在充足磷 (HP, 200 μM Pi)和缺乏磷 (LP, 5 μM Pi)條件下生長30天。主分蘗頂部的第三片葉子用于分析。B和C, 在HP和LP條件下WT, a-Ox和b-Ox的磷的測量值。FW表示新鮮重量。值表示平均值±SD，重復3次。

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鑒于RLI1a和RLI1b對R1BS (RLI1a binding site, NAKATNCN)和P1BS(PHR1 binding site,GNATATNC) 表現出不同的DNA結合親和力，假設RLI1a和RLI1b可能在體內優先靶向不同的基因。為了驗證這一假設，我們對35SRLI1a-FLAG和35S-RLI1b-FLAG苗期植株采用CUT&Tag技術進行了基因組表觀分析，然后進行了高通量測序。測序數據顯示，與RLI1b相比，RLI1a在體內結合更多的DN**段，有11417個DNA結合峰值，而RLI1b只有3415個峰值(圖5,A和B)。其他候選靶基因相關序列位于峰值的上游3k bp內至下游1k bp處。正如轉錄因子所期望的那樣，RLI1a和RLI1b經常結合在基因的轉錄起始位點(TSSs)附近。RLI1a靶向6716個基因，而RLI1b只靶向水稻基因組中的2884個基因(圖5C)。其中2047個基因是RLI1a和RLI1b的共同靶基因，4669個基因和837個基因分別是RLI1a和RLI1b的共同靶基因(圖5)。這些結果表明，在體內RLI1a比RLI1b具有更廣泛的靶基因范圍。

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圖5 在體內，RLI1a比RLI1b具有更廣泛的靶標。A、RLI1a和RLI1b在染色體不同位置的峰數。從含有RLI1a-FLAG和RLI1b-FLAG的轉基因植物的嫩枝中分離細胞核，使用CUT&Tag試劑盒(NovoNGS)進行ChIP-seq分析。B, RLI1a和RLI1b靶向的峰總數。誤差條為SD (n = 2)。C，表示RLI1a和RLI1b靶向基因重疊的Venn圖。這些數字代表RLI1a或RLI1b直接靶向的基因數量。BR生物合成和信號轉導相關基因或磷內穩態和信號轉導相關基因。

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該研究中使用的CUT&Tag試劑盒來自近岸蛋白，近岸蛋白的NovoNGS^? CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit已助力多篇高分文章發表，是您表觀遺傳研究的得力助手！

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考慮到RLI1a而非RLI1b調控葉片傾角，且在RLI1a ChIP-Seq數據中檢測到許多BL生物合成和信號基因，我們推測，RLI1a直接調控 brassinolide （BL）相關基因的表達，從而調節BL含量和信號，從而影響水稻生長。為了驗證這一假設，我們設計了針對BL生物合成基因啟動子(D11、DWF4、BZR1)的特異性引物，并將其用于ChIP-qPCR分析。和陽性對照相似，在D11、DWF4和BZR1 pro位點檢測到顯著富集的RLI1a- flag而非RLI1b- flag(圖6A)，表明RLI1a與這些啟動子結合，可能影響D11、DWF4和BZR1在體內的表達。

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圖6 A, ChIP-qPCR分析D11、DWF4、BZR1、BU1啟動子上RLI1a和RLI1b的表達水平。

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另外，與不同品系間BL含量的差異以及激活BL信號的是RLI1a而不是RLI1b的觀點一致，在對照條件下以及在BL和brassinazole (BRZ，一種BL生物合成特異性抑制劑tor)處理下，RLI1b- ox的葉片傾角與WT相似。這些結果表明，RLI1a直接調控BL生物合成基因的表達，從而調節BL內穩態和信號轉導，進而影響水稻生長。

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該研究還從20種具有代表性的陸地植物中構建了MYBCC蛋白的系統發育樹，并在被子植物中發現了RLI1特異的分支。對這支枝的基因進行結構分析，預測大多數基因會發生類似的AS類型與水稻RLI1類似，在擬南芥、大豆和玉米中檢測到兩個編碼假定的MYB和MYB- cc蛋白的轉錄亞型。這些結果表明，RLI1樣基因的AS在雙子葉和單子葉中都是保守的。

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蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。

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