腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)是影響腫瘤進展和治療結果的重要因素。在多種癌癥中，TME亞型與患者對免疫治療的反應相關。大多數先前的研究都集中在不同細胞成分在TME中與免疫治療療效相關的作用。然而，TME的具體結構及其在免疫治療療效中的作用在很大程度上仍然未知。本文將空間轉錄組學與單細胞rna測序和多重免疫熒光相結合，鑒定TME中決定抗pd -1治療肝細胞癌(HCC)患者免疫治療效果的特定空間結構。本文發現了一個腫瘤免疫屏障(TIB)結構，一個由SPP1巨噬細胞和癌相關成纖維細胞(CAFs)組成的空間生態位，位于腫瘤邊界附近，這與免疫檢查點阻斷的有效性有關。此外，文章剖析了惡性細胞、SPP1t巨噬細胞和CAFs之間的配體受體網絡;即缺氧微環境促進SPP1表達，SPP1巨噬細胞與CAFs相互作用刺激細胞外基質重塑，促進TIB結構形成，從而限制免疫在腫瘤核心的浸潤。臨床前，阻斷小鼠SPP1或巨噬細胞特異性缺失SPP1可增強小鼠肝癌抗pd -1治療的療效，同時伴有CAF浸潤減少和細胞毒性t細胞浸潤增加。文章發現SPP1+巨噬細胞與CAFs相互作用形成的TIB結構與免疫治療效果有關。因此，通過阻斷SPP1破壞TIB結構可能被認為是一種相關的治療方法，可以增強免疫檢查點阻斷在HCC中的治療效果。

應用多組學技術鑒定HCC微環境中的TIB(腫瘤免疫屏障)結構。

scRNA-Seq、ST、mIHC（多色熒光免疫組化）

1.?ST揭示了與免疫治療效果相關的TIB微環境結構

文章對8例接受抗pd -1治療的HCC患者的腫瘤切片進行了ST（無應答，n = 5；應答者，n = 3）和鄰近正常組織切片（n = 3）?；颊?1和#5的腫瘤組織與鄰近正常組織配對(圖1A)。質量控制后，根據無偏聚類和斑點特征，將鄰近正常組織的spot分類為HP和ADH1B高表達的肝細胞、RGS5和MYH11高表達的肌成纖維細胞/周細胞、PTPRC、CD3D、CD79A和COL1A1高表達的免疫/成纖維細胞或FXYD2和KRT7高表達的膽管細胞。腫瘤區域spot分為肝細胞、免疫/成纖維細胞、肌成纖維細胞/周細胞、表達SPP1、CD68、LUM和TIMP1的SPP1+巨噬細胞/CAFs和表達AFP和APOA2的 惡性肝細胞（圖2B-G）。

文章發現SPP1+巨噬細胞和CAFS共定位于腫瘤區域周圍，在免疫檢查點治療不響應患者中形成一個免疫屏障結構（圖2C）。此外，mIHC染色顯示，SPP1陽性和aSMA 陽性細胞在腫瘤周圍非常接近，ICB無應答者的雙陽性細胞對數量明顯高于應答者(圖2K-L)，這表明這兩種細胞類型之間的潛在串串有助于形成與免疫治療效果相關的TIB結構。

2.?對ICB無響應的HCC配對鄰近正常和腫瘤組織的繪制單細胞轉錄組圖譜

為了更好地了解ICB無應答者中TIB的細胞組成，文章對來自6例ICB無應答者的HCC腫瘤和鄰近正常組織進行了單細胞轉錄組測序。質量控制后對剩余83,793 個細胞進行后續分析?；趍arker基因共定義出六種主要細胞大類：T/NK細胞、髓系細胞、B/漿細胞、成纖維細胞、內皮細胞和肝細胞/雙能細胞（圖3A,B）。

在所有患者的腫瘤和鄰近正常組織中均可發現六種主要細胞類型（圖3C）。其中髓系細胞和成纖維細胞的比例在腫瘤組織中顯著增加（圖3C）。組織、腫瘤和鄰近正常組織之間浸潤細胞類型的差異表明，TME的動態重塑在無反應性HCC中起重要作用（圖3D-G）。

3. 在存在TIB結構的腫瘤區域中SPP1+巨噬細胞顯著富集

為了進一步探索存在TIB結構的ICB非響應患者髓系細胞異質性，文章用類型特異性marker將相鄰正常組織中的3034個細胞和腫瘤中的7978個細胞分為12個亞型，包括5種表達C1QA和CD68的巨噬細胞亞型（SPP1+巨噬細胞、FOLR2+巨噬細胞、CXCL10+巨噬細胞、CCL3L1+巨噬細胞、增殖型巨噬細胞）、表達CD14的2種單核細胞亞型（經典單核細胞、促炎單核細胞）、表達CSF3R的中性粒細胞、3種DC亞型（DC1、DC2、漿細胞樣DCs）和表達TPSB2的肥大細胞（圖4A）。

為了驗證本文的髓系細胞聚類的準確性，本文將此數據集與Sharma、張澤民等人的數據集進行了整合。SPP1+巨噬細胞與Sharma等人TAM2簇一致，其中SPP1和TREM2表達水平特別高，這些細胞在一定程度上與T細胞相互作用，并與免疫抑制有關。SPP1+巨噬細胞是是張澤民數據集中MJ –C2-C1QA細胞簇。FOLR2+巨噬細胞與Sharma等人的TAM1簇和Zhang等人的MJ -C3-APOE簇相似，與Zhang等人的MJ -C2-C1QA簇重疊。CCL3L1+和CXCL10+巨噬細胞與Sharma等人的單核細胞來源細胞和Zhang等人的MJ - c2 -C1QA簇相似。

攜帶SPP1的細胞主要分布在TAM2簇，攜帶FOLR2的細胞位于TAM1簇Sharma等人的數據集。但在Zhang等人的數據集中，SPP1和FOLR2在MJ -C2-C1QA集群中表達，MJ -C2-C1QA集群中表達SPP1和FOLR2的細胞沒有重疊，這表明SPP1+巨噬細胞作為一種獨立的亞型存在，可能在TME中發揮重要作用。

文章比較了腫瘤和鄰近正常組織之間髓系細胞亞型的比例（圖4B、C）。SPP1+巨噬細胞的百分比在腫瘤中顯著增加（圖4C），而漿細胞樣DC和DC1簇在鄰近正常組織中富集，如先前報道，腫瘤組織中FOLR2+巨噬細胞的比例往往高于鄰近正常組織。

4. SPP1+巨噬細胞與腫瘤進展和缺氧微環境有關

為了進一步探究細胞亞型和臨床相關性，本文采用CIBERSORTx 在TCGA-LIHC 大隊列中評估48中細胞類型的免疫浸潤情況，結果發現，在TCGA-LIHC數據集中，與鄰近正常組織相比，腫瘤中SPP1+巨噬細胞的浸潤明顯豐富（圖4D）。流式分選結果也顯示，無應答者腫瘤組織中SPP1+巨噬細胞浸潤明顯高于應答者（圖4E）。mIHC多重免疫熒光結果也顯示CD68與SPP1共定位（圖4F）。

值得注意的是，在三個獨立的隊列中，HCC和SPP1+巨噬細胞浸潤較高的患者的總生存期較短（圖4G）和TCGA-LIHC隊列(唯一可獲得無進展生存信息的隊列)中較短的無進展生存期，而其他巨噬細胞亞型與患者預后沒有顯著關聯。

文章進一步證實SPP1蛋白在腫瘤組織中特異性表達增加(在鄰近正常組織中不表達)，并且在HCC腫瘤微陣列中與預后不良有關（圖4H-I）。在TCGA-LIHC隊列中，SPP1+巨噬細胞的比例在晚期增加（圖4J），表明SPP1+巨噬細胞可能促進腫瘤進展。

KEGG富集分析結果顯示SPP1+巨噬細胞富集到糖酵解、氧化磷酸化、和HIF-1信號通路，而其他巨噬細胞亞型抗原加工提成被顯著富集（圖4K）。體外實驗顯示缺氧可以誘導體外THP-1細胞中SPP1的高表達（圖4L），而SPP1+巨噬細胞的吞噬評分最低，這表明SPP1+巨噬細胞確實受到缺氧的影響，促進腫瘤進展，抑制吞噬。

6. TIB結構干擾惡性細胞和免疫細胞之間的相互作用，從而限制對免疫治療的反應。

進一步看SPP1+ macrophages/CAFs 在TIB結構中重要程度，細胞通訊結果顯示，在ICB無應答者中，SPP1+巨噬細胞/CAFs簇與HCC的相互作用權重最強，但與免疫細胞的相互作用較弱，而在應答者中，SPP1+巨噬細胞/CAFs、成纖維細胞和免疫細胞與HCC的相互作用權重相當（圖6A、B）。根據對已知免疫特征的分析，在ICB無應答者中，CD8 T淋巴細胞（CD3D和CD8A）和細胞毒性標志物（GZMB、GZMK和PRF1）有限或沒有浸潤到被TIB結構包圍的腫瘤中（圖6C），而在沒有TIB結構的ICB應答者中觀察到免疫細胞浸潤（圖6D）。

此外，SPP1+巨噬細胞/CAFs的髓系細胞免疫抑制特征和ECM特征的特征評分相對較高（圖6E），提示SPP1+巨噬細胞可能與免疫抑制功能有關，CAFs可能與ECM成分的產生有關。為了探索SPP1+巨噬細胞/CAFs在HCC免疫治療中的功能作用，本文計算了T細胞炎癥基因表達譜(GEP)的特征評分，文章發現在TIB包裹的HCC組織中GEP評分較低，并且用于評估GEP評分的基因在TIB包膜的HCC組織中并不豐富(圖6F,G)。此外，mIHC染色顯示，SPP1+巨噬細胞傾向于定位于腫瘤邊界，而CD8+T細胞定位于ICB無應答者的TIB外而不是腫瘤核心(圖6H)，而應答者的腫瘤中SPP1+巨噬細胞浸潤較少，CD8 T細胞浸潤較多(圖6I)。綜上所述，這些結果表明與SPP1+巨噬細胞相關的TIB結構的形成可能有助于HCC的免疫抑制微環境。?

7. 靶向SPP1可以破壞TIB結構并使HCC對免疫治療敏感

為了進一步驗證SPP1的缺失會消除CAFs對免疫微環境的抑制作用，從而使殺傷T細胞浸潤腫瘤核心。本文使用單核細胞選擇性缺失Spp1的小鼠品系(Spp1fff;Lyz2-Cre)建立腫瘤模型，與Spp1f小鼠相比，抗pd -1治療Lyz2-Cre小鼠腫瘤生長速度明顯下降，治療效果較好（圖7A）。流式細胞術分析顯示，抗pd -1治療顯著增加了Spp1腫瘤區域的腫瘤浸潤性CD8+T細胞（圖7B）和顆粒酶B CD8+T細胞（圖7C）的數量;Lyz2-Cre老鼠。mIHC染色結果顯示，PD-1后Lyz2-Cre小鼠腫瘤區域CD8+細胞上顆粒酶B染色強度高于其他組（圖7D-E）。此外，我們在Hepa 1-6肝腫瘤模型中檢測了抗spp1和抗pd -1聯合治療的效果。與SPP1條件敲除小鼠的結果相似，在攜帶Hepa 1-6腫瘤的免疫正常小鼠中，與單獨治療相比，聯合抗SPP1和抗pd -1治療誘導腫瘤生長減少，顯著提高了應答率（圖7F）。抗spp1和抗pd -1聯合治療也顯著增加了腫瘤區域顆粒酶B和CD8+T細胞的數量（圖7G-H）。重要的是，我們發現在SPP1條件敲除組或抗SPP1處理后，aSMAt成纖維細胞的表達下降，抗spp1或抗pd -1治療略微增加了荷瘤GDL小鼠的總生存期，而抗spp1和抗pd -1聯合治療可顯著提高荷瘤GDL小鼠的總生存期（圖7I）。此外，抗spp1和抗pd -1聯合治療也顯著降低了aSMA+成纖維細胞的比例，增加了腫瘤區域CD8+細胞的比例（圖7J）。這些結果表明阻斷SPP1可以增強抗pd -1免疫治療的療效。因此，SPP1可能作為一種有價值的生物標志物，用于預測需要免疫治療的HCC患者的預后，而靶向SPP1可能在未來進一步使HCC對免疫檢查點抑制劑敏感。

綜上所述，本文的研究整合了單細胞和ST數據，以鑒定和表征HCC TME中與免疫治療療效相關的TIB結構。文章發現了SPP1+巨噬細胞可作為HCC潛在的臨床治療靶點。阻斷這個靶點會破壞TIB并促進CD8+ T細胞向腫瘤的浸潤。這種新的治療策略，可用于破壞細胞間相互作用，并可與免疫檢查點抑制劑聯合使用，以提高HCC的治療效果。