TERT是端粒酶活性調節的限速酶。在TERT抑制劑中，BIBR1532被認為是一種理想的先導化合物，因為它具有高選擇性、強效性和細胞通透性，并且在眾多的臨床前和臨床研究中，BIBR1532作為一種無不良副作用的抗癌藥物被廣泛研究。目前，許多研究表明，TERT在缺血性腦損傷時被誘導表達，且具有神經保護作用，但TERT是如何參與神經元的局部缺血耐受機制尚不清楚。
?
?
2021年9月13日，在JNC雜志發表的一篇重磅研究使用TERT抑制劑BIBR1532藥物預處理神經元，通過CUT&Tag實驗獲取原代神經元TERT與全基因組DNA的結合位點并進行系統性數據分析及驗證,旨在進一步揭示缺血耐受的相關機制，以及為藥物性預處理用于腦卒中、衰老、癡呆及神經退行性病變治療提供新思路。TERT是端粒酶活性調節的限速酶。在TERT抑制劑中，BIBR1532被認為是一種理想的先導化合物，因為它具有高選擇性、強效性和細胞通透性，并且在眾多的臨床前和臨床研究中，BIBR1532作為一種無不良副作用的抗癌藥物被廣泛研究。目前，許多研究表明，TERT在缺血性腦損傷時被誘導表達，且具有神經保護作用，但TERT是如何參與神經元的局部缺血耐受機制尚不清楚。
?
?
2021年9月13日，在JNC雜志發表的一篇重磅研究使用TERT抑制劑BIBR1532藥物預處理神經元，通過CUT&Tag實驗獲取原代神經元TERT與全基因組DNA的結合位點并進行系統性數據分析及驗證,旨在進一步揭示缺血耐受的相關機制，以及為藥物性預處理用于腦卒中、衰老、癡呆及神經退行性病變治療提供新思路。
?
?
?
?
? ? 前期通過對小鼠初級神經進行分離并建立OGD模型，發現30min OGD誘導的IPC對隨后的OGD損傷具有最顯著的保護作用。用IPC處理細胞10-60min后， RT-qPCR和westernblot分析顯示，IPC后相比對照組，TERT表達下調。接著，用不同濃度的TERT的抑制劑BIBR1532對神經元進行預處理，發現低于20μM的BIBR1532不會對神經元細胞產生明顯的毒性，且在2μM時具有顯著的缺血耐受性和最大的保護作用。同時發現2μM 的BIBR1532處理細胞24h后，TERT活性明顯受到抑制，而TERT蛋白表達水平沒有顯著變化（圖1）。這些結果表明，BIBR1532可以給予神經元缺血耐受性保護。 ? ? ? ? 圖1：BIBR1532對神經元進行預處理后TERT的表達變化[1] ? ? ? 接下來，為了驗證BIBR1532預處理會改變原代神經元細胞的轉錄譜，作者用對照載體或BIBR1532預處理初級神經元24h后，收集樣本并進行ChIP-seq 分析，可能因為原代神經元細胞的內在挑戰以及方法學的低信噪比，導致未能獲得大量TERT-ChIP 的峰值分析，為了克服這個困難，他們使用了信噪比高，重復性好，靈敏度高的Novoprotein CUT&Tag試劑盒。作者先用CUT&Tag實驗分析了RNA聚合酶II結合位點和組蛋白修飾的轉錄作用，成功驗證了CUT&Tag實驗可在初級神經元上應用（圖2a）。后續用CUT&Tag定位TERT結合位點，結果對照組發現1690個峰，BIBR1532預處理組發現1652個峰，且TERT與神經元中的許多非端粒位點結合?；蚪M注釋分析發現，對照組中56%的峰和預處理組中43%的峰位于啟動子區域(圖2b)。TERT特異性結合代表啟動子結合峰，而IgG對照組僅顯示背景信號，且結合峰位于TSS周圍的啟動子區域內 (圖2c和d)。通過Motif分析，找到了motif A和motif B，分別是對照和預處理神經元基因組中與TERT結合的唯一序列，并且TERT結合基因的轉錄也可能受其它轉錄因子的共同調控（圖2e）。 ? ? ? ? ? 圖2：BIBR1532預處理后初級神經元全基因組的tert結合譜的變化[1] ? ? ? 后續通過測序數據的深入分析，發現預處理誘導的TERT-啟動子結合基因參與了氧化應激反應、細胞氧化還原穩態和細胞氧化應激反應，并且BIBR1532預處理可優先增強TERT與線粒體抗氧化基因啟動子的結合，從而激活它們的轉錄。通過DCFH-DA熒光染色、超氧化物DHE染色、MitoSOX染色及JC-1染色測定線粒體膜電位(ΔΨM)，最終得出BIBR1532預處理可通過降低ROS來應對缺血性損傷誘導的氧化應激，最終增強線粒體氧化應激抗性。 ? ? 最后，通過內源性TERT的慢病毒shRNA轉染，證實了原代神經元中TERT的下調(圖3a和b)。在細胞活力測定中，臺盼藍染色和PI染色均發現BIBR1532預處理后細胞死亡顯著減少。而scramble對照組相比TERT敲除組，敲除破壞了BIBR1532預處理對OGD誘導的細胞死亡保護 (圖3c -e)。同理驗證了，TERT在BIBR1532誘導的氧化應激抵抗中的作用。以上表明，TERT在BIBR1532預處理誘導的神經元細胞缺血耐受中發揮重要作用。 ? ? ? ? 圖3：敲除TERT可消除BIBR1532預處理在OGD損傷后促進細胞存活的作用[1] ? ? ? 綜上所述，他們的研究表明BIBR1532通過轉錄重編程誘導神經元的缺血耐受，鑒于氧化應激是包括神經退行性疾病和腦損傷在內的許多神經疾病的主要病理機制之一，本研究中發現的BIBR1532介導的TERT靶基因表達激活和內源性氧化應激抵抗機制可能為腦保護提供一種新的治療策略。這預示BIBR1532可能成為一種有前途的藥物預處理劑，用于預防和治療腦損傷和其他神經功能障礙所致的缺血和氧化損傷。 ? 在此研究中，近岸蛋白提供了NovoNGS??CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity?Kit (for Illumina?)（Cat.No.:N259-YH01）高靈敏度試劑盒，產品引用文獻已有10余篇,為研究蛋白與DNA互作提供了幫助，為整個研究奠定了基礎。 ? ? ? 近岸蛋白相關產品 貨號 產品名稱 NovoNGS? ChiTag? 2.0 Transposase NovoNGS? ChiTag? 2.0 Transposome
?
?
?
? 參考文獻： 1. Pharmacological preconditioning by TERT inhibitor BIBR1532 confers neuronal ischemic tolerance through TERT-mediated transcriptional reprogramming.[J]. Xuemin Xie et al. Journal of Neurochemistry.2021. ? 現在下單，還有機會參與促銷活動哦！ ? ? ? NovoNGS?、ChiTag?是蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司的注冊商標。其他商標歸其所有者所有。
?
?