TERT是端粒酶活性調(diào)節(jié)的限速酶。在TERT抑制劑中，BIBR1532被認(rèn)為是一種理想的先導(dǎo)化合物，因?yàn)樗哂懈哌x擇性、強(qiáng)效性和細(xì)胞通透性，并且在眾多的臨床前和臨床研究中，BIBR1532作為一種無不良副作用的抗癌藥物被廣泛研究。目前，許多研究表明，TERT在缺血性腦損傷時被誘導(dǎo)表達(dá)，且具有神經(jīng)保護(hù)作用，但TERT是如何參與神經(jīng)元的局部缺血耐受機(jī)制尚不清楚。
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2021年9月13日，在JNC雜志發(fā)表的一篇重磅研究使用TERT抑制劑BIBR1532藥物預(yù)處理神經(jīng)元，通過CUT&Tag實(shí)驗(yàn)獲取原代神經(jīng)元TERT與全基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行系統(tǒng)性數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證,旨在進(jìn)一步揭示缺血耐受的相關(guān)機(jī)制，以及為藥物性預(yù)處理用于腦卒中、衰老、癡呆及神經(jīng)退行性病變治療提供新思路。TERT是端粒酶活性調(diào)節(jié)的限速酶。在TERT抑制劑中，BIBR1532被認(rèn)為是一種理想的先導(dǎo)化合物，因?yàn)樗哂懈哌x擇性、強(qiáng)效性和細(xì)胞通透性，并且在眾多的臨床前和臨床研究中，BIBR1532作為一種無不良副作用的抗癌藥物被廣泛研究。目前，許多研究表明，TERT在缺血性腦損傷時被誘導(dǎo)表達(dá)，且具有神經(jīng)保護(hù)作用，但TERT是如何參與神經(jīng)元的局部缺血耐受機(jī)制尚不清楚。
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2021年9月13日，在JNC雜志發(fā)表的一篇重磅研究使用TERT抑制劑BIBR1532藥物預(yù)處理神經(jīng)元，通過CUT&Tag實(shí)驗(yàn)獲取原代神經(jīng)元TERT與全基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行系統(tǒng)性數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證,旨在進(jìn)一步揭示缺血耐受的相關(guān)機(jī)制，以及為藥物性預(yù)處理用于腦卒中、衰老、癡呆及神經(jīng)退行性病變治療提供新思路。
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? ? 前期通過對小鼠初級神經(jīng)進(jìn)行分離并建立OGD模型，發(fā)現(xiàn)30min OGD誘導(dǎo)的IPC對隨后的OGD損傷具有最顯著的保護(hù)作用。用IPC處理細(xì)胞10-60min后， RT-qPCR和westernblot分析顯示，IPC后相比對照組，TERT表達(dá)下調(diào)。接著，用不同濃度的TERT的抑制劑BIBR1532對神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)低于20μM的BIBR1532不會對神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性，且在2μM時具有顯著的缺血耐受性和最大的保護(hù)作用。同時發(fā)現(xiàn)2μM 的BIBR1532處理細(xì)胞24h后，TERT活性明顯受到抑制，而TERT蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化（圖1）。這些結(jié)果表明，BIBR1532可以給予神經(jīng)元缺血耐受性保護(hù)。 ? ? ? ? 圖1：BIBR1532對神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理后TERT的表達(dá)變化[1] ? ? ? 接下來，為了驗(yàn)證BIBR1532預(yù)處理會改變原代神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，作者用對照載體或BIBR1532預(yù)處理初級神經(jīng)元24h后，收集樣本并進(jìn)行ChIP-seq 分析，可能因?yàn)樵窠?jīng)元細(xì)胞的內(nèi)在挑戰(zhàn)以及方法學(xué)的低信噪比，導(dǎo)致未能獲得大量TERT-ChIP 的峰值分析，為了克服這個困難，他們使用了信噪比高，重復(fù)性好，靈敏度高的Novoprotein CUT&Tag試劑盒。作者先用CUT&Tag實(shí)驗(yàn)分析了RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn)和組蛋白修飾的轉(zhuǎn)錄作用，成功驗(yàn)證了CUT&Tag實(shí)驗(yàn)可在初級神經(jīng)元上應(yīng)用（圖2a）。后續(xù)用CUT&Tag定位TERT結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果對照組發(fā)現(xiàn)1690個峰，BIBR1532預(yù)處理組發(fā)現(xiàn)1652個峰，且TERT與神經(jīng)元中的許多非端粒位點(diǎn)結(jié)合。基因組注釋分析發(fā)現(xiàn)，對照組中56%的峰和預(yù)處理組中43%的峰位于啟動子區(qū)域(圖2b)。TERT特異性結(jié)合代表啟動子結(jié)合峰，而IgG對照組僅顯示背景信號，且結(jié)合峰位于TSS周圍的啟動子區(qū)域內(nèi) (圖2c和d)。通過Motif分析，找到了motif A和motif B，分別是對照和預(yù)處理神經(jīng)元基因組中與TERT結(jié)合的唯一序列，并且TERT結(jié)合基因的轉(zhuǎn)錄也可能受其它轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控（圖2e）。 ? ? ? ? ? 圖2：BIBR1532預(yù)處理后初級神經(jīng)元全基因組的tert結(jié)合譜的變化[1] ? ? ? 后續(xù)通過測序數(shù)據(jù)的深入分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理誘導(dǎo)的TERT-啟動子結(jié)合基因參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且BIBR1532預(yù)處理可優(yōu)先增強(qiáng)TERT與線粒體抗氧化基因啟動子的結(jié)合，從而激活它們的轉(zhuǎn)錄。通過DCFH-DA熒光染色、超氧化物DHE染色、MitoSOX染色及JC-1染色測定線粒體膜電位(ΔΨM)，最終得出BIBR1532預(yù)處理可通過降低ROS來應(yīng)對缺血性損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，最終增強(qiáng)線粒體氧化應(yīng)激抗性。 ? ? 最后，通過內(nèi)源性TERT的慢病毒shRNA轉(zhuǎn)染，證實(shí)了原代神經(jīng)元中TERT的下調(diào)(圖3a和b)。在細(xì)胞活力測定中，臺盼藍(lán)染色和PI染色均發(fā)現(xiàn)BIBR1532預(yù)處理后細(xì)胞死亡顯著減少。而scramble對照組相比TERT敲除組，敲除破壞了BIBR1532預(yù)處理對OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡保護(hù) (圖3c -e)。同理驗(yàn)證了，TERT在BIBR1532誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激抵抗中的作用。以上表明，TERT在BIBR1532預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞缺血耐受中發(fā)揮重要作用。 ? ? ? ? 圖3：敲除TERT可消除BIBR1532預(yù)處理在OGD損傷后促進(jìn)細(xì)胞存活的作用[1] ? ? ? 綜上所述，他們的研究表明BIBR1532通過轉(zhuǎn)錄重編程誘導(dǎo)神經(jīng)元的缺血耐受，鑒于氧化應(yīng)激是包括神經(jīng)退行性疾病和腦損傷在內(nèi)的許多神經(jīng)疾病的主要病理機(jī)制之一，本研究中發(fā)現(xiàn)的BIBR1532介導(dǎo)的TERT靶基因表達(dá)激活和內(nèi)源性氧化應(yīng)激抵抗機(jī)制可能為腦保護(hù)提供一種新的治療策略。這預(yù)示BIBR1532可能成為一種有前途的藥物預(yù)處理劑，用于預(yù)防和治療腦損傷和其他神經(jīng)功能障礙所致的缺血和氧化損傷。 ? 在此研究中，近岸蛋白提供了NovoNGS??CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity?Kit (for Illumina?)（Cat.No.:N259-YH01）高靈敏度試劑盒，產(chǎn)品引用文獻(xiàn)已有10余篇,為研究蛋白與DNA互作提供了幫助，為整個研究奠定了基礎(chǔ)。 ? ? ? 近岸蛋白相關(guān)產(chǎn)品 貨號 產(chǎn)品名稱 NovoNGS? ChiTag? 2.0 Transposase NovoNGS? ChiTag? 2.0 Transposome
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? 參考文獻(xiàn)： 1. Pharmacological preconditioning by TERT inhibitor BIBR1532 confers neuronal ischemic tolerance through TERT-mediated transcriptional reprogramming.[J]. Xuemin Xie et al. Journal of Neurochemistry.2021. ? 現(xiàn)在下單，還有機(jī)會參與促銷活動哦！ ? ? ? NovoNGS?、ChiTag?是蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司的注冊商標(biāo)。其他商標(biāo)歸其所有者所有。
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