聽覺系統在哺乳動物感覺系統非常獨特，其具有極致的生物物理性能。遺傳性耳聾是最常見的感音神經性疾病，也是典型的單基因病，具有高度的遺傳異質性，分為非綜合征和綜合征兩大類，分別占80％和20％左右。迄今為止，已確定約125個基因與非綜合征型相關，約300個基因與綜合征型相關。此外，遺傳性耳聾的一些致病基因在一種特定的耳蝸細胞類型中起關鍵作用。
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耳蝸細胞，特別是聽覺毛細胞的數量非常少（在人類的耳蝸中少于15,000個）,這為人們破譯該器官發育和生理基礎的分子機制帶來了阻礙。近年來,通過耳蝸基因、細胞療法以及一些深入的轉錄組學研究，人們已經分析了特定的耳蝸細胞類型，但目前還未有針對所有耳蝸細胞類型的全面標準化轉錄組圖譜，能夠涵蓋該感覺器官的整個分化過程，直至其完全成熟。
近期，法國巴黎西岱大學巴斯德研究所的研究團隊利用小鼠模型，分析了超120,000個細胞，共涵蓋耳蝸發育分化的三個關鍵階段：P8（聽力產生前）、，P12（聽力產生時）和P20（耳蝸基本成形），繪制了全面的小鼠耳蝸單細胞轉錄組圖譜。通過將單細胞、單核RNA測序（scRNAseq和snRNAseq）與廣泛的RNA原位雜交檢測（RNA scope）相結合，表征了幾乎所有耳蝸細胞類型的轉錄組學特征。此外，研究團隊還鑒定了三種先前未知的細胞類型，為破譯基底膜生物物理特性的異位組織的分子機制奠定了基礎。相關研究發表在PNAS期刊上，文章題為“Single-cell transcriptomic profiling of the mouse cochlea: An atlas for targeted therapies”
為建立一個完整、捕獲所有細胞類型的小鼠耳蝸綜合轉錄組圖譜，研究人員優化了單細胞懸液和細胞核懸液的制備，以便對出生后三個關鍵時間段（P8、P12和P20）的小鼠耳蝸細胞進行檢測（圖1）。通過scRNAseq和snRNAseq技術，分別從P8、P12和P20耳蝸樣本中獲得22,827、26,169和39,010個細胞，從P8耳蝸樣本中獲得28,822個細胞核。基于不同細胞類型之間差異最大的基因以及已知標志物的分析，將轉錄組圖譜中的細胞劃分出37種細胞類型，然后通過RNAscope檢測對差異表達最顯著的轉錄本進行分析，以確定不同細胞類型的比例。
圖1. 耳蝸細胞類型的轉錄組學表征。來源：PNAS
研究團隊整合了來自三個分化階段的單細胞轉錄組數據，將數據集分成兩個主要集合：循環細胞（主要是血細胞）和非循環細胞，后者進一步分化為軟質和軟骨/骨質耳蝸組織的細胞。根據典型標記物表達對循環細胞進行人工表征。非循環細胞類型可根據其來源的耳蝸亞區細分成六個主要的細胞群，即側壁細胞群、神經感覺上皮的細胞群和螺旋神經節細胞群，剩余三種耳蝸細胞類型可統一歸為“周圍結構”細胞群。
研究團隊首先對表達骨功能相關基因的耳蝸細胞進行分類，確定了組成骨細胞的三個不同的成熟階段。通過分析參與成骨細胞分化的Dlx5和Runx2的表達來鑒定耳蝸成骨前細胞、成骨細胞和骨細胞。其中，骨細胞約占總骨細胞群的90%-95%。
除上述三種已知的細胞類型外，研究人員還鑒定出對應兩種未知的細胞類型的細胞簇，以下稱為周圍結構1和2細胞（SS1, SS2）。SS1特異表達基因是Osr2和Chrdl1，SS2特異表達基因是Bmp6和Col1a1。GO分析顯示，上述基因涉及成骨細胞分化、骨化、軟骨發育、牙發生和骨骼系統發育的生物學過程。綜上，除了三種經典骨細胞外，研究團隊還揭示了兩種轉錄組學上不同的細胞類型，其定位于海綿狀骨結構，并具有骨細胞樣轉錄組學譜，但與成骨細胞前、成骨細胞和骨細胞不同。
圖2. 骨細胞類型及新細胞群的轉錄組學表征。來源：PNAS
在周圍結構中，研究團隊確定了3個與骨骼無關的細胞簇，第一個差異表達Slc26a7，主要存在于Reissner膜的上皮細胞（RM）中；第二個細胞簇差異共表達編碼Fxyd2和鉀離子通道Kcnk2的基因；第三個細胞簇顯示強烈、特異性的Emilin2表達，其可編碼基底膜的主要細胞外基質糖蛋白。研究團隊將上述非骨細胞命名為前庭階邊緣細胞（SVB），其具有與其他已知耳蝸細胞不同的獨特轉錄組學特征。
基于掃描電子顯微鏡和RNAscope分析，研究團隊發現SVB細胞在軟骨殼細胞空泡化過程中可能維持薄層RM的結構，促進前庭階腔管化，并在后期階段，將會有一小簇細胞持續存在于RM的基部。
圖3. 新細胞群SVB的鑒定與定位。來源：PNAS
研究團隊分析了P8和P20之間，每種耳蝸細胞類型的基因表達的變化，以評估其個體和相對成熟過程。結果顯示，在P8和P20之間，SVB細胞、RM細胞和成骨細胞等基因表達出現輕微至中度的變化；纖維細胞、骨細胞、SS1和SS2細胞等細胞類型顯示出重大變化；纖維細胞的變化最為顯著。
圖4. 非綜合征性耳聾基因的耳蝸細胞表達模式。來源：PNAS
綜上所述，該研究提供了耳蝸發育過程中的全面的單細胞圖譜的展示，揭示了在出生后發育的不同時間點，耳蝸細胞具有最強差異表達的基因；并同時提供了多種耳蝸細胞類型的詳細轉錄組學數據，為了解遺傳性耳聾的致病機理提供了基礎。綜上，這一詳細的基因表達圖譜為破譯控制耳蝸細胞分化和成熟的基因調控網絡鋪平了道路，對開發有效的靶向治療方法至關重要。
Jean, P., Wong Jun Tai, F., Singh-Estivalet, A., et?al. Single-cell transcriptomic profiling of the mouse cochlea: An atlas for targeted therapies.?PNAS,?120(26), e2221744120.
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.2221744120
