?一、 microRNA(small RNA)測序概述
上海伯豪生物技術有限公司應用Illumina第二代高通量測序技術對microRNA及Small RNA文庫進行測序，可以一次獲得數百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同物種、不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的microRNA及其表達差異。同時，新一代測序技術在microRNA互補鏈、microRNA編輯、microRNA異構體檢測、新microRNA預測及microRNA靶基因分析方面也具有重要應用意義，為研究microRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。上海伯豪生物技術有限公司應用Illumina第二代高通量測序技術對microRNA及Small RNA文庫進行測序，可以一次獲得數百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同物種、不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的microRNA及其表達差異。同時，新一代測序技術在microRNA互補鏈、microRNA編輯、microRNA異構體檢測、新microRNA預測及microRNA靶基因分析方面也具有重要應用意義，為研究microRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。
二、 miRNA測序技術特點
1.高靈敏度：理論上可以檢測單個細胞中一個拷貝的microRNA；
2.高精度：可以檢測microRNA單個堿基的差異；
3.不受先驗信息的干擾，既能鑒定已知microRNA，又有能力發現新的microRNA；
4.保留定向信息，用于鏈特異的表達分析；
5.利用Barcode在單次運行中經濟地分析多個樣品。
三、上海伯豪microRNA（Small RNA)測序服務內容
????? 對客戶提供的total RNA或microRNA樣品進行定量檢測，檢測合格后進行microRNA文庫構建、簇生成及上機測序。上海伯豪生物microRNA sequencing服務，為您提供從樣本抽提到數據分析的全面綜合服務，服務內容包括：樣品抽提質檢, 文庫建立，測序，生物信息學分析以及數據報告。
數據分析流程
1． MicroRNA長度分布統計以驗證試驗可靠性
應用fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)對測序原始reads進行預處理，去除接頭序列以及低質量序列（包括模糊堿基N，堿基質量小于10以及長度小于18nt的序列），最終給出處理結果統計表以及長度分布圖。
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2． MicroRNA比對注釋統計
將測序得到的序列與Sanger miRBase數據庫，已知rRNA、tRNA、重復區、RefSeq數據庫，以及其它非編碼數據庫如ncRNA，piRNA，Rfam數據庫比對，對已知microRNA進行注釋。
下表為經過注釋的結果，其中分別列出和miRBase數據庫，pirna數據庫，Rfam數據庫以及ncRNA數據庫的比對情況。
下圖為針對miRBase種Sus scrofa物種進行的比對注釋統計：
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由之前所得的注釋結果，可以作圖來更進一步展示其結果：
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對整體的注釋結果，還可以采取進一步的分析，例如：
（1） 統計堿基偏好性，下圖就是測序所得序列分別在21,22,23,24長度上的5’堿基分布情況。
（2）對于測序所得序列，可以統計出其正負鏈分布情況，以找尋生物學上的特征。
針對某單一microRNA，也可以對其進行更深度的分析。
例如，對其序列的匹配情況進行分別統計：
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還可以對其對應的microRNA前體二級結構進行觀察。
3．? 其它Small RNA的分類注釋
將測序得到的序列與物種所對應的基因組數據庫比對，對有注釋的reads的來源進行分類統計，鑒定并統計出已知的microRNA及其它各種不同種類的small RNA分子。
如下圖，經過與數據庫進行分別比對，可以鑒定并統計出包括tRNA、rRNA、snoRNA、snRNA的數量及分布。
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4． 新microRNA預測
MicroRNA前體的標志性發卡（hairpin）結構能夠用來預測新的microRNA。對于測序結果中未比對注釋上的序列，我們將其與該物種的全基因組序列進行比對分析，通過折疊模型分析，若有序列位于莖環結構上，則初步判定該序列為一個候選的新microRNA。
對于預測出的新microRNA，會統計并列出其所位于的染色體，起始位置，終止位置，正負鏈，以及數目，長度，GC含量，最小自由能等數值。
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對于新microRNA，我們還會計算并繪制出其前體的二級結構，以及其與成熟microRNA之間的位置關系。
5． 飽和度分析圖表
飽和度分析：隨著測序量的增加，檢測到的miRBase上的microRNA是否隨之上升。我們會將注釋結果按比例劃分作圖，以觀察樣品測序結果注釋的趨勢，發現其在生物學上的合理性。
6． 樣本間microRNA表達差異的篩選
采用DEGseq R語言包結合perl腳本將樣品按照客戶的分組情況（如：對照組與實驗組），進行microRNA表達量的比較分析。在差異分析中，采用TPM（Transcripts per million，公式為：單一microRNA reads數×106/總reads數）作為標準化數據。
結果展示如下：
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差異microRNA表達模式聚類分析
可以對組間差異表達的
7． 靶基因預測
采用miranda軟件，對microRNA序列以及對應物種的基因組cDNA序列進行可能的靶位點預測。
Miranda軟件比對結果示意圖如下：
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或采用TargetScan數據庫關聯microRNA的靶基因，結果形式包含microRNA和靶基因的相關信息。
8． GO功能顯著性富集分析（靶基因）
9． Pathway顯著性富集分析（靶基因）
伯豪案例
應用案例一：雌雄同株異花的毛白楊microRNA的性能分析以及對靶基因表達的影響
本研究報道了與花發育相關的miRNAs以及它們的靶基因，根據基因注釋，將所有的靶基因分為四類。第一類，花發育相關：Pto-F6, Pto-F11, Pto-F14, Pto-F19, Pto-25, Pto-36, Pto-F51, Pto-F54以及Pto-F66。第二類，Ca2+轉運相關：Pto-F28 和 Pto-F45（雌花特異性miRNA），Pto-F16（雄花特異性miRNA）。第三類，激素調節相關：10個miRNAs（除Pto-F6以外均為雌花特異性）。第四類，與DNA甲基化相關：3個miRNAs。
原文出處： Sexual dimorphism floral microRNA profiling and target gene expression in andromonoecious poplar (Populus tomentosa). PLoS One. 2013, 8(5):e62681.（IF3.730）?
應用案例二：MeCP2調控DGCR8/Drosha復合物抑制miRNA加工和樹突發育。?
MeCP2是一種甲基化DNA結合蛋白，負責招募轉錄抑制復合物并且關閉基因表達，重要轉錄調控因子。?
人類MeCP2基因的突變或者拷貝數增多均會導致孤獨癥（Autism）等發育性神經系統疾病。中科院上海生科院神經科學研究所仇子龍研究組利用高通量測序技術對MeCP2基因敲除小鼠海馬區的成熟小RNA進行定量分析，發現 MeCP2抑制了大量小RNA的產生。該研究揭示了孤獨癥相關蛋白MeCP2參與小RNA剪切加工的新功能，并提示此功能很是MeCP2基因突變導致發育性神經系統疾病的相關致病機理。?
原文出處：MeCP2 Suppresses Nuclear MicroRNA Processing and Dendritic Growth by Regulating the DGCR8/Drosha Complex p547. Developmental Cell.2014,28, 547–60.（IF：10.366）
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miRNA測序服務應用案例