實驗原理
基因定點突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法改變目的基因的序列，包括堿基的插入、缺失、點突變等?；蚨c突變是基因研究中比較常用的方法，可以短時間內(nèi)研究目的DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征。
定點突變需要設(shè)計特定的突變引物。引物長度一般為25-45 bp，建議選擇30-35bp長度的引物p。引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求引物兩邊都能與模板搭上，所以引物的兩邊各設(shè)至少12個bp。以要突變的位點堿基為中心，加上兩邊11-12 bp的序列。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗。同時需要設(shè)計一條反向互補的引物。為保證PCR反應(yīng)正常進(jìn)行，引物設(shè)計完成后需計算Tm值，若Tm值不合適，可以適量調(diào)整引物長度。
實驗材料
PCR引物，質(zhì)?；蛘呋蚪M模板，PCR Buffer，PCR用高保真酶，ddH2O。
實驗過程
1、PCR擴增
30 μL PCR（phusion）體系如下：
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成分 |
體積（ul） |
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水 |
18.2 |
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Buffer |
6 |
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DMSO |
0.9 |
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dNTP |
0.6 |
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酶 |
0.3 |
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引物F+R |
1.5+1.501 |
|
DNA模板 |
? |
?
2、膠回收
第一輪PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行膠回收后再進(jìn)行二輪PCR。
將第一輪PCR得到的條帶進(jìn)行切膠回收后，作為模板進(jìn)行二輪PCR，二輪PCR的引物已第一輪PCR所用的兩端引物。二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后需要進(jìn)行純化回收，為下一步的酶切做準(zhǔn)備。
?
3、酶切
通過酶切回收目的基因片段、載體時，避開基因中的酶切位點，選擇合適限制性內(nèi)切酶。當(dāng)酶切回收目的基因時要注意目的基因裝在PENTER載體的位置。用限制性內(nèi)切酶處理目的載體時，要將載體片段的量控制在2μg以內(nèi)，并在酶切反應(yīng)后進(jìn)行去磷酸化處理。
?
30μL酶切體系
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成分 |
體積（ul） |
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載體DNA |
1-2ug |
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10X Buffer |
1 |
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E1 |
0.8 |
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E2 |
0.8 |
|
水 |
補足30ul |
?
4、連接
根據(jù)片段的大小以及基因的亮度來調(diào)節(jié)片段連接的比例，一般亞克隆的連接體系如下
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成分 |
體積（ul） |
|
載體DNA |
2 |
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目的基因 |
6 |
|
T4連接酶 |
1 |
|
T4 Buffer |
1 |
將連接產(chǎn)物放于22℃保持1~2h。
?
5、轉(zhuǎn)化
（1）冰上融化感受態(tài)DH5a,，加1ug/ul的質(zhì)粒1ul于10ul感受態(tài)中，冰上放置30min。
（2）42℃水浴鍋中熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上2min-5mins。
（3）超凈臺內(nèi)向各管含質(zhì)粒的感受態(tài)中加入500ul-1ml高壓過的LB培養(yǎng)基，37℃，低速培養(yǎng)1h。
（4）取100ul轉(zhuǎn)化菌涂板，至菌液快干時，倒置于37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)12-16小時，次日觀察菌落生長情況。
6、獲取正確質(zhì)粒
（1）挑取轉(zhuǎn)化子
挑去大腸桿菌轉(zhuǎn)化子至正確的抗性培養(yǎng)基中（KANA、AMP）,并對HM號及孔號做好記錄。
（2）酶切驗證
將提取好的質(zhì)粒用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗證。
10μL酶切驗證體系：
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成分 |
體積（ul） |
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質(zhì)粒DNA |
3 |
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10X Buffer |
1 |
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E1 |
0.25 |
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E2 |
0.25 |
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水 |
5.5 |
?
37℃保持30min~1h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
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