編者按
顱內動脈瘤（Intracranial aneurysm，IA），是一種常見的腦血管疾病，多發生在顱內動脈管壁上的異常膨出，常造成蛛網膜下腔出血，甚至導致死亡或嚴重殘疾。盡管全基因組關聯研究已確定幾個與IA相關的常見遺傳變異位點，但目前對IA具有較大影響的遺傳基因變異機制尚不清楚。
今天，我們分享由耶魯大學醫學院發表在Nature Medicine上的題為“PPIL4 is essential for brain angiogenesis and implicated in intracranial aneurysms in humans”的一項研究成果。該研究利用斑馬魚揭示了一種新的PPIL4依賴的Wnt信號通路機制，并發現PPIL4是IA的易感基因，表明了PPIL4-Wnt通路在腦血管發育中的核心地位，為顱內動脈瘤的遺傳風險評估和精準治療提供了理論依據。
全外顯子組測序（WES）結果顯示，在家族性和IA索引病例中，肽基脯氨酰順反式異構酶NIMA相互作用蛋白4(PIN4)的PPIL4中罕見有害突變顯著富集。斑馬魚實驗結果發現，PPIL4缺失會導致腦出血、腦血管形態缺陷和Wnt信號受損等。野生型PPIL4通過結合血管生成調節劑、Wnt激活劑JMJD6來增強Wnt信號通路，而IA突變型的PPIL4則不會增強Wnt信號通路。
文章題目
PPIL4 is essential for brain angiogenesis and implicated in intracranial aneurysms in humans
雜志：Nature Medicine（IF=58.7）
發表時間：2021年12月9日
作者：Tanyeri Barak, Emma Ristori, Murat Günel，Stefania Nicoli，Ketu Mishra-Gorur等
單位：美國耶魯大學醫學院等
01、研究亮點
利用全外顯子組測序發現了PPIL4這一顱內動脈瘤易感基因，在家族性和散發性顱內動脈瘤（IA）患者中首次發現PPIL4基因的罕見缺失突變顯著富集，揭示了其與IA發病風險的直接關聯；
• 利用斑馬魚模型發現PPIL4缺失會導致腦血管形態異常、顱內出血及Wnt信號受損，實現了PPIL4-Wnt信號通路的機制突破；
• 成功揭示了PPIL4依賴性信號通路在維持腦血管結構功能中起關鍵作用，其突變可破壞血管內皮細胞的穩態，導致動脈瘤形成。
02、研究背景
顱內動脈瘤多為發生在顱內動脈管壁上的異常膨出，是造成蛛網膜下腔出血，甚至導致死亡或嚴重殘疾的首位病因。在腦血管意外中，僅次于腦血栓和高血壓腦出血，位居第三。數據顯示，顱內動脈瘤影響近3%的人口，全世界每年報告約50萬出血性中風，近四分之一的受害者在到達醫院之前死亡。
盡管全基因組關聯研究已確定幾個與IA相關的常見遺傳變異位點，但要預測誰可能易患這種遺傳性顱內動脈瘤是非常困難的，目前仍難以確定可能引發成人動脈瘤風險增加的基因，識別具有大效應的顱內動脈瘤的遺傳形式也尚未成功。
本研究中，研究人員發現肽基脯氨酰異構酶樣4（PPIL4）依賴的相關信號通路機制，該機制對于腦血管的生成和腦血管完整性地維持起到重要作用，并與顱內動脈瘤相關。
研究人員利用全外顯子組測序分析了300多名顱內動脈瘤患者的基因組，發現與一般人群相比，PPIL4在顱內動脈瘤患者中顯著突變。
他們利用斑馬魚實驗驗證了PPIL4對于腦血管的形態功能性和完整性起重要作用，發現PPIL4通過與互作蛋白相互作用增強相關信號通路進而促進腦血管發育和完整性。實驗結果顯示，ppil4缺失的斑馬魚中，腦血管分支損傷嚴重，數量減少；在回補實驗中，加入PPIL4野生型可以增加腦血管分支的產生，而G132S突變則不發揮功能。
這不僅為疾病發病機制提供了遺傳和機制窗口，而且為IA篩查、早期診斷和治療的新途徑提供了顯著的潛力，為臨床診斷和治療提供新思路。
03、研究結果
1. 全外顯子組測序分析罕見且有害的PPIL4 基因突變
為了探究IA的罕見變異，研究人員從66個歐洲顱內動脈瘤家庭隊列中篩選出4個家庭，并對其進行全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing, WES）分析，發現PPIL4 存在一種錯義突變(G132S)，并預測出PPIL4的第132位甘氨酸突變為絲氨酸（G132S），該突變破壞了臨近氨基酸V129和遠端V12的空間位阻。
隨后，研究團隊在430個歐洲索引病例中發現了PPIL4突變并篩選了三種罕見的有害突變，而2886名對照隊列中沒有發現有害突變。該結果驗證了，PPIL4突變在高血壓等疾病患者群體中顯著富集，突變攜帶者的動脈瘤風險顯著高于普通人群。
圖1
2. 利用斑馬魚評估ppil4對腦血管系統的作用
PPIL4（Peptidylprolyl Isomerase-Like 4）是一種肽基脯氨酰順反異構酶，包含一個RNA識別基序、一個類似PPIase的功能結構域，但其基因功能尚不清楚。為了探究PPIL4的基因功能，研究人員利用斑馬魚基因編輯技術構建了ppil4突變斑馬魚。
為了進一步評估ppil4對腦血管系統的作用，研究人員對斑馬魚血管內皮細胞進行綠色熒光蛋白(GFP)標記后發現，PPIL4對脊椎動物腦血管生成至關重要。實驗結果表明，ppil4缺失的斑馬魚中，腦血管分支損傷嚴重，數量減少；在回補實驗中，加入PPIL4野生型可以增加腦血管分支的產生，而G132S突變則不發揮功能，這表明ppil4 在區域特異性血管生成中的重要作用和G132S突變的致病性。
圖2
圖3
此外，研究人員還使用腎上腺素開展了斑馬魚血流動力學應激實驗，發現野生型PPIL4可通過激活Wnt信號促進血管生成，而IA相關突變型則喪失這一功能。結果顯示：與野生型相比，ppil4−/−胚胎在大腦和主動脈弓動脈均出現更高頻率的出血，該表型可通過單細胞期注射hPPIL4WT mRNA進行挽救，而注射hPPIL4G132S mRNA則沒有挽救效果。這表明，PPIL4對腦血管的形態功能性和完整性起著重要作用。
圖4
3. PPIL4與JMJD6相互作用的機制研究
隨后，研究人員通過單細胞RNA測序及KEGG信號通路分析發現，Wnt信號通路被富集。免疫共沉淀與免疫熒光染色實驗表明，PPIL4與JMJD6相互作用，且突變體PPIL4 G132S會影響其與JMJD6的相互作用。
進一步實驗發現，PPIL4與JMJD6相互作用是Wnt信號激活的核心環節，該復合物通過調控β-catenin的穩定性促進血管內皮細胞增殖和遷移。PPIL4突變導致JMJD6結合能力下降，進而抑制Wnt通路，最終引發腦血管結構缺陷。這表明，PPIL4 是一種新的Wnt信號通路，PPIL4 缺失觀察到的腦血管缺陷可能是由于PPIL4-JMJD6相互作用，Wnt信號減弱造成的。
圖5
圖6
04、編者點評
本研究利用斑馬魚發現了肽基脯氨酰異構酶樣4（PPIL4）依賴的相關信號通路機制，揭示了PPIL4對腦血管生成至關重要，并與顱內動脈瘤相關。PPIL4通過與已知的血管生成調節劑和Wnt信號分子JMJD6結合，增強了Wnt信號，進而促進腦血管發育和完整性。該機制對腦血管的生成和腦血管完整性地維持起到重要作用，為臨床診斷和治療提供了新思路。
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