標(biāo)準(zhǔn)化流程的高安全性NDV載體定制方案
在腫瘤免疫治療領(lǐng)域中，溶瘤病毒療法一直被視為一個(gè)充滿前景的方向。其理論構(gòu)想十分精妙：利用一種能選擇性識(shí)別癌細(xì)胞的病毒，侵入其中進(jìn)行增殖，最終撐破細(xì)胞，釋放腫瘤抗原，從而調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)的攻擊能力。
但現(xiàn)實(shí)應(yīng)用卻遠(yuǎn)非理想。無(wú)論是基于腺病毒、皰疹病毒還是呼腸孤病毒的方案，在臨床實(shí)踐中都遭遇了幾個(gè)核心瓶頸：
1、靶向輸送效率低下。絕大多數(shù)溶瘤病毒目前只能依賴局部瘤內(nèi)注射。如果采用靜脈給藥，它們往往在血液循環(huán)中就被抗體快速中和，或者被肝臟等器官截留，無(wú)法有效抵達(dá)腫瘤病灶。
2、免疫激活強(qiáng)度不足。腫瘤組織內(nèi)部通常存在強(qiáng)烈的免疫抑制環(huán)境。即使病毒成功感染并破壞部分癌細(xì)胞，所引發(fā)的免疫應(yīng)答也常常較弱，難以逆轉(zhuǎn)整體的抑制狀態(tài)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞既難以浸潤(rùn)也無(wú)法充分活化。
3、治療效果難以維持。由于病毒載體本身會(huì)被機(jī)體識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)，迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。隨著治療反復(fù)進(jìn)行，病毒被清除的效率越來(lái)越高，使得療效出現(xiàn)快速衰退，無(wú)法持久。
2025年2月，廣西醫(yī)科大學(xué)與多家合作機(jī)構(gòu)于國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊《Cell》上發(fā)布了一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性成果：該研究將異種器官移植領(lǐng)域長(zhǎng)期存在的超急性排斥反應(yīng)——通常是一種致命性障礙——巧妙地轉(zhuǎn)化為抗擊腫瘤的創(chuàng)新策略。通過(guò)基因工程技術(shù)，研究人員對(duì)新城疫病毒（NDV）進(jìn)行修飾，使其攜帶豬特有的α1,3GT基因。當(dāng)這種工程化病毒感染人體腫瘤細(xì)胞時(shí)，會(huì)強(qiáng)制細(xì)胞表面表達(dá)“豬”特征抗原（αGal），相當(dāng)于為腫瘤披上了一層外源性標(biāo)識(shí)。這會(huì)立即激活了人體內(nèi)天然存在的大量抗Gal抗體，引發(fā)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)和血栓形成，從而精準(zhǔn)摧毀腫瘤。
為驗(yàn)證這一方法，團(tuán)隊(duì)利用CRISPR基因編輯技術(shù)構(gòu)建了全球領(lǐng)先的原發(fā)性肝癌猴子模型。此外，在一項(xiàng)針對(duì)20名晚期難治性癌癥患者的臨床試驗(yàn)中，該療法實(shí)現(xiàn)了90.0%的疾病控制率，且未出現(xiàn)嚴(yán)重副作用。此項(xiàng)技術(shù)突破了傳統(tǒng)溶瘤病毒療法在靜脈給藥和免疫激活方面的瓶頸，為全身轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療開(kāi)辟了一條全新的“反向轉(zhuǎn)化”路徑。
01 測(cè)定患者和食蟹猴體內(nèi)抗Gal抗體，構(gòu)建食蟹猴原發(fā)性肝癌模型
對(duì)患者與食蟹猴體內(nèi)抗αGal抗體的檢測(cè)顯示，兩者在IgM水平上沒(méi)有明顯差異，但患者組的IgG水平高于食蟹猴。在患者中，抗αGal的IgG與IgM水平相當(dāng)，而食蟹猴的IgG水平則顯著低于其IgM。這些結(jié)果印證了非人靈長(zhǎng)類(lèi)與人類(lèi)之間的高度相似性，食蟹猴能夠有效模擬人體對(duì)αGal抗原的免疫排斥反應(yīng)。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)多年努力，成功建立了食蟹猴的原發(fā)性肝癌模型。具體方法是將CRISPR-Cas9系統(tǒng)經(jīng)門(mén)靜脈注入肝臟，誘導(dǎo)Pten和p53基因發(fā)生功能缺失突變。該研究選用新城疫病毒（NDV）作為遞送載體，這種禽源病毒對(duì)人體安全性高，并天然傾向于靶向腫瘤組織。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，研究人員將豬源的α1,3GT基因整合到NDV基因組中，獲得工程化病毒NDV-GT。當(dāng)NDV-GT感染腫瘤細(xì)胞后，不僅能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，還會(huì)促使細(xì)胞合成α1,3GT酶，從而在腫瘤細(xì)胞表面糖鏈末端添加αGal抗原。這使得原本隱匿的癌細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識(shí)別為“異種細(xì)胞”，從而引發(fā)強(qiáng)烈的免疫攻擊。
圖1 患者和原發(fā)性肝癌猴子體內(nèi)存在的抗gal抗體分析以及NDV-GT的工程
02 NDV-GT的溶瘤作用及其在CRISPR介導(dǎo)的原發(fā)性肝癌食蟹猴模型中的潛在機(jī)制研究
在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NDV-GT處理的腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)了血栓結(jié)構(gòu)，同時(shí)新生血管的生成受到明顯抑制。該治療還顯著上調(diào)了顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)，并促進(jìn)了CD4+與CD8+ T細(xì)胞向腫瘤部位的浸潤(rùn)。此外，腫瘤組織中可見(jiàn)活化補(bǔ)體成分C3b和C4b的大量沉積。關(guān)鍵的是，阻斷αGal抗原可顯著削弱NDV-GT的腫瘤殺傷效果。這些結(jié)果提示，NDV-GT不僅具備直接的溶瘤活性，還能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)αGal，可能引發(fā)類(lèi)似超急性排斥的反應(yīng)，并啟動(dòng)抑制腫瘤生長(zhǎng)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
圖2 食蟹猴HCC腫瘤的H&E染色及免疫熒光成像：PAF、纖維蛋白原、CD31、CD105、顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)及CD4+、CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)
03 芯片技術(shù)鑒定了NDV-GT治療后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽分析揭示了凋亡相關(guān)改變
通過(guò)蛋白芯片技術(shù)，研究人員檢測(cè)了NDV-GT治療后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步顯示，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的多條信號(hào)通路，如JAK-STAT、PI3K-Akt、Ras和IL-17通路中，均有蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步的富集分析突出表明，Akt-IKK-NF-κB信號(hào)通路被顯著激活，提示NDV-GT可能通過(guò)該通路影響細(xì)胞凋亡過(guò)程。使用Akt抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果證實(shí)，抑制該通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為肝癌的治療機(jī)制提供了新的理解。
圖3 NDV-GT直接溶解腫瘤，激活抗癌免疫級(jí)聯(lián)
04 NDV-GT療法在治療23例難治性癌癥（肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、食管癌、直腸癌和乳腺癌）及黑色素瘤患者中的應(yīng)用
該研究團(tuán)隊(duì)首先在食蟹猴模型中完成了NDV-GT療法的安全性評(píng)價(jià)。基于此，一項(xiàng)探索性臨床試驗(yàn)招募了23名患有多種難治性實(shí)體瘤（包括肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、食管癌、直腸癌、乳腺癌及黑色素瘤）的患者，以評(píng)估該療法的初步療效。
療效依據(jù)完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）進(jìn)行評(píng)價(jià)。在可評(píng)估的20例患者中，1例達(dá)到CR，6例達(dá)到PR，11例維持SD，總體疾病控制率（DCR）達(dá)到90.00%。治療期間未觀察到顯著的毒性反應(yīng)。
圖4 NDV-GT在多發(fā)性晚期癌癥患者中有效抑制腫瘤進(jìn)展
05 部分患者治療效果和臨床結(jié)局展示
該臨床研究共納入23名晚期難治性癌癥患者，包括肝細(xì)胞癌（3例）、卵巢癌（6例）、直腸癌（3例，其中2例中途退出）、肺癌（3例，其中1例中途退出）、乳腺癌（2例）、食管癌（1例）、黑色素瘤（1例）和宮頸癌（4例）。
以其中一位肝細(xì)胞癌患者（P1）為例，影像學(xué)評(píng)估顯示，在接受NDV-GT治療1.5個(gè)月后，其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶顯著縮小或完全消退。研究表明，該療法能夠增強(qiáng)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答，重新激活免疫記憶，并減輕腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)。在安全性方面，除觀察到輕微的炎癥反應(yīng)外，NDV-GT治療未引起顯著的血液學(xué)或腎功能異常，顯示出良好的生物安全性特征。
圖5 NDV-GT治療1例伴有肺轉(zhuǎn)移的難治性HCC患者（P1）的臨床結(jié)果
這項(xiàng)研究巧妙地將異種移植中致命的超急性排斥反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為攻擊腫瘤的全新武器。這種借助物種間天然免疫差異來(lái)設(shè)計(jì)治療策略的方法，為合成生物學(xué)和免疫治療提供了一個(gè)典范。它同時(shí)提示，未來(lái)或可基于類(lèi)似的異種抗原原理開(kāi)發(fā)更多療法。該成果也再次印證，恰當(dāng)?shù)姆侨遂`長(zhǎng)類(lèi)模型是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)成功的關(guān)鍵。盡管高達(dá)90%的疾病控制率令人振奮，但當(dāng)前研究的患者數(shù)量仍較少，屬于早期探索階段。其能否最終轉(zhuǎn)化為患者總生存期的顯著延長(zhǎng)，尚需未來(lái)大規(guī)模、多中心的III期臨床試驗(yàn)加以證實(shí)。
總體而言，這種為癌細(xì)胞“偽裝”上異種標(biāo)識(shí)以吸引自身免疫系統(tǒng)攻擊的思路，雖然看似奇特，卻展現(xiàn)出了強(qiáng)大的潛力。隨著后續(xù)研究的深入，我們期待這一策略能為更多晚期癌癥患者帶來(lái)新的治療選擇。
基于這項(xiàng)將基礎(chǔ)研究成功轉(zhuǎn)化為臨床潛力的范例，其核心工具——NDV載體的定制化開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)，已成為推動(dòng)相關(guān)療法落地的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
「DIFF CRO」NDV載體溶瘤病毒構(gòu)建與藥效評(píng)價(jià)服務(wù)
NDV原理和用途
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)屬于副粘病毒科Avulavirus屬，是一種負(fù)鏈包膜RNA病毒，其基因組包含N、P、M、F、HN和L六大基因以及非編碼調(diào)控序列(圖6）。具有良好的穩(wěn)定性。作為RNA病毒，NDV與宿主細(xì)胞DNA重組的可能性十分有限。與其他病毒載體相比，NDV病毒載體由于宿主范圍的限制，具有良好的安全性，同時(shí)，除養(yǎng)殖場(chǎng)專(zhuān)業(yè)作業(yè)人員外，人群體內(nèi)沒(méi)有預(yù)先存在的NDV抗體。
圖6. NDV病毒基因組示意圖
NDV載體的構(gòu)建方法
NDV（新城疫病毒）載體的構(gòu)建主要基于反向遺傳操作技術(shù)（Reverse Genetics），該技術(shù)是一種通過(guò)操作病毒遺傳物質(zhì)（如cDNA克隆）重構(gòu)活病毒，從而研究基因功能或開(kāi)發(fā)新型疫苗的方法（圖7）。流程包括：①提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；②將cDNA插入特定載體（如質(zhì)粒或痘苗病毒載體）；③通過(guò)基因編輯（插入/缺失/突變外源基因）修飾基因組；④將修飾后的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，拯救重組病毒。
圖7.病毒反向遺傳操作技術(shù)
「DIFF CRO」NDV載體構(gòu)建優(yōu)勢(shì)
服務(wù)案例：迪福潤(rùn)絲NDV溶瘤病毒候選株對(duì)成瘤小鼠腫瘤的抑制作用
圖8.以NDV為載體的改造溶瘤病毒候選株(NDV-OV1,NDV-OV2,NDV-OV3)給藥后，成瘤小鼠腫瘤體積變化。A:LLC成瘤小鼠;B:B16F10成瘤小鼠。
「DIFF CRO」溶瘤病毒載體構(gòu)建與藥效評(píng)價(jià)服務(wù)內(nèi)容：
「DIFF CRO」憑借其特色的重組病毒載體平臺(tái)，提供從病毒載體構(gòu)建、改造、擴(kuò)增純化到臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)的一站式、高效率CRO服務(wù)。公司通過(guò)對(duì)病毒株基因組進(jìn)行精準(zhǔn)改造，以提升溶瘤病毒的抗腫瘤活性，并憑借優(yōu)化的流程實(shí)現(xiàn)快速的方案輸出和顯著縮短研發(fā)周期。
參考文獻(xiàn)：
Zhong L, Gan L, Wang B, et al. Hyperacute rejection-engineered oncolytic virus for interventional clinical trial in refractory cancer patients. Cell. 2025 Feb 20;188(4):1119-1136.e23.