編者按
乳腺癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，其包括多種不同的亞型，這些亞型在遺傳、病理、臨床治療及預后上各不相同。傳統的乳腺癌細胞系研究模型不能完全符合臨床腫瘤發病的實際病理過程及其腫瘤異質性的特征。乳腺癌類器官（Organoids）是一種基于3D細胞培養（Three-dimensional cells culture）系統建立的模型，在保留患者腫瘤的分子表型和基因型變化的同時，再現原發腫瘤的異質性，因此被應用于腫瘤發病機制和抗腫瘤藥物篩選的研究中。目前，乳腺癌的中醫藥研究大多以細胞系和人源性腫瘤異種移植為主，類器官的相關研究則相對缺乏。
今天我們一起來分享2024年6月一篇最新綜述性文章——《乳腺癌類器官研究進展及中醫藥應用展望》，該綜述簡要介紹乳腺癌類器官培養體系的發展，以及其在生命科學研究中的應用，以期為中醫藥乳腺癌相關研究提供思路。
文章題目
乳腺癌類器官研究進展及中醫藥應用展望
雜志：《世界科學技術-中醫藥現代化》
發表時間：2024年6月4日
作者：高陽，劉勝，周細秋，史有陽等
單位：上海中醫藥大學附屬龍華醫院乳腺外科、上海中醫藥大學研究生院、上海中醫藥大學中醫外科研究所等
01、研究背景
乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，其發病率位居女性惡性腫瘤的第一位，嚴重威脅女性健康，乳腺癌的診療研究在分子生物學技術的幫助下，愈發細化、深入，塑造符合臨床腫瘤發病及腫瘤異質性的模型對乳腺癌的綜合治療意義重大。
目前傳統的乳腺癌相關的中醫藥研究主要依賴于乳腺癌細胞系和人源性腫瘤組織異種移植（Patient derived xenografts，PDX），乳腺癌細胞系構建簡單、經濟并可進行高通量藥物篩選，被廣泛應用于乳腺癌的基礎研究和藥物敏感性等研究，由于缺乏異質性，對癌癥的研究往往過于片面，且經過上千代的傳代培養、無數實驗室的流通，細胞的基因組和行為都背離了當初的模樣；PDX雖然能夠保持較高的瘤內異質性和分子多樣性，但其研究周期長、移植成功率低，無法進行高通量藥物篩選。
乳腺癌類器官（Organoids）是指將手術中獲得的新鮮乳腺腫瘤組織在體外利用3D培養技術形成的具有一定空間結構的三維細胞復合體，與傳統的腫瘤模型相比，具有與來源乳腺癌組織相似的結構特征和功能特性，能夠很好地保持原始腫瘤的異質性，對于中醫藥防治乳腺癌的基礎研究及臨床診療應用廣闊。本文就乳腺癌類器官培養體系的發展，以及其在生命科學和中醫藥相關的應用作了綜述。
02、乳腺癌類器官培養
1. 乳腺癌類器官研究歷程
20世紀80年代，Roelofs等率先開發了三維培養物，1990年，證明了不同的細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）對小鼠乳腺細胞形態和功能的影響和重要性。Lee等描述了正常和惡性乳腺細胞的3D培養方案。有研究者培養出長期腸道類器官，并應用于結腸、肺、前列腺、胃、肝、胰腺以及乳腺等器官，同時形成了類器官生物樣本庫。Twigger等重建了乳腺的三維組織結構。2017年，Rosenbluth建立了人乳腺癌類器官生物庫，標志著乳腺癌類器官培養體系的成熟。
要的價值。
2. 正常乳腺組織及乳腺癌類器官培養基組成成分
德國Linnemann等采用浮動膠原蛋白凝膠法建立乳腺類器官模型，乳腺組織通過切碎、消化、冷凍保存后進行過濾，以去除組織碎片和細胞聚集體。細胞以2D形式種植、培養，制成凝膠，正常乳腺類器官培養基（見表1）。選擇Ⅰ型膠原作為底物，是因其構成了人體乳腺（Mammary gland，MG）細胞外基質的主要成分，并提供了可被用來模擬不同微環境的特性。此外，還觀察到乳腺癌細胞系在自由漂浮的膠原凝膠中產生管狀結構。
表1
Sachs等從BC術后患者身上獲取腫瘤組織，結合機械與物理操作，分離出正常組織，獲取BC細胞，然后將組織碎片消化、去除上清、靜置、混勻成勻漿狀；將培養的細胞與基質凝膠混合，放置成膠，乳腺癌類器官培養基組成（見表2）。同時，發現神經調節蛋白1是人表皮生長因子受體（Human epidermal growth factor receptor，HER）酪氨酸激酶-3和-4的配體，與乳腺發育和腫瘤發生有關，將其添加到BC類器官培養基中可以高效地生成BC類器官，并使其長期擴增20代。
表2
03、乳腺癌類器官的研究及應用
1. 研究腫瘤的發生機制
BRCA1的缺失導致乳腺腫瘤的發生，Wang等通過構建小鼠BRCA1乳腺癌模型培養乳腺癌類器官發現，BRCA1缺失類器官表現出上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）進程?？p隙連接蛋白43（Connexin43，Cx43）在人乳腺癌組織中普遍下調。當連接蛋白在癌細胞中過表達時，腫瘤生長減緩，細胞恢復一些分化結構的能力。
McLachlan等研究了MDA‐MB‐231類器官中的連接蛋白腫瘤抑制模式，為縫隙連接蛋白細胞間隙連接通訊（Gap junction intercellular communication，GJIC）對腫瘤的獨立抑制作用提供了模型。Dekkers等靶向敲除正常乳腺類器官的抑癌基因，重述了乳腺癌的發生，增加了對乳腺腫瘤發生過程中關鍵驅動因素的認識。Bhatia等建立了一個來源于患者的腫瘤類器官（Patient-derived organoids，PDO）乳腺癌生物樣本庫，其中的類器官模型再現了大規模乳腺癌基因組，上述發現揭示了癌癥驅動基因，為推測乳腺腫瘤發生的機制提供了見解。
2. 闡明腫瘤轉移的關鍵機制
Cheung等通過培養乳腺癌類器官確定最早入侵的是高表達的CK14細胞。小鼠中CK14敲除的乳腺癌類器官失去了侵襲性，這為研究乳腺癌轉移的起始機制奠定了理論基礎。Nguyen-Ngoc等使用乳腺癌類器官模擬浸潤性乳腺癌微環境發現，ECM誘導的信號變化可以啟動侵襲和局部播散。
Cheung等發現，在人類乳腺癌的主要亞型中，表達基底上皮基因（如細胞角蛋白-14和p63）的特定癌細胞促進集體侵襲，表明上皮亞群之間的異型相互作用是集體侵襲的基礎。Park等利用乳腺類器官分析其致癌功能，發現了3種與乳腺細胞增殖和侵襲相關的剪接因子。Diermeier等從惡性和健康小鼠組織生長的類器官發現，非編碼RNA導致腫瘤生成的類器官的分支減少，發揮了癌癥細胞遷移的特異性作用。
因此，以上研究通過對類器官基因敲除、模擬乳腺癌在體微環境闡明了乳腺癌侵襲轉移機制。
3. 抗腫瘤藥物篩選及開發
乳腺癌類器官的主要用途之一是藥物測試[8,32]，即從患者樣本產生的類器官系暴露于不同乳腺癌亞型的標準治療。大多數依賴人表皮生長因子2受體（Human epidermal growth factor 2 receptor，Her-2）的類器官對Her-2靶向治療敏感，而大多數不過度表達受體的類器官對Her-2靶向治療耐藥。
值得注意的是，盡管受體高表達，一些類器官被發現對Her-2靶向治療耐藥，這表明PDO中存在其他耐藥機制，這與臨床研究一致。體現了將基因組研究與類器官的體外分析相結合的價值。Walsh等使不同亞型BC/PDO接受對應的BC藥物治療，預測藥物反應，發現與體內反應相似，也證實了類器官反應的異質性。
Chen等對76個乳腺癌類器官細胞系分成2組進行藥物篩選。PDO藥物表型分析顯示，PDO對藥物治療的應答具有顯著變異性。同時，使用6種微管靶向藥物對57個乳腺癌類器官細胞系進行了RNA測序，結果表明，乳腺癌類器官對微管靶向藥物的反應與其轉錄譜高度相關，能夠預測特殊敏感藥物。
4. 藥物療效與毒性評估
類器官可以預測異種移植的治療反應，并測量來自人腫瘤的類器官的抗腫瘤藥物反應，同時測試在患者匹配的正常組織上測試藥物毒性。
光學代謝成像（Optical metabolic imaging，OMI）能夠檢測調節癌癥細胞；Phan等在乳腺癌類器官模型下發到曲妥珠單抗下調乳腺癌中的乳酸脫氫酶，進而評估原發性乳腺腫瘤類器官對臨床抗癌藥物的反應。
在藥物毒性評估方面，研究人員通過微芯片培養乳腺癌類器官表明，該方法檢測不同抗癌藥物細胞毒性的結果與傳統的MTT法一致。
5. 指導乳腺癌個體化治療
類器官為藥物-基因型相關性的機制研究提供了一個良好的平臺，使用CRISPR/Cas9技術來研究致癌轉化和模型腫瘤發生。Matano等利用CRISPR/Cas9研究乳腺腫瘤，探索CRISPR/Cas9在brca1缺陷乳腺腫瘤中PARP抑制劑的反應機制。這將有助于在相關患者材料中研究單基因或多基因事件的影響。
04、中醫藥領域乳腺癌類器官應用展望
1. 中醫藥領域乳腺癌類器官的應用
惡性細胞的轉錄組譜高度依賴于微環境及腫瘤細胞的固有特性。類器官的基因組和轉錄組特征與原發腫瘤相比，能夠明確類器官是否是腫瘤異質性的真實模型。乳腺癌細胞系在三維培養中所采用的形態至少部分地反映了其基因表達譜。類器官模式體系的產生，使器官的形態及功能在顯微鏡下同時觀察成為可能，對于精準評價中藥藥效、明確藥效作用靶標、揭示中藥方藥尤其是中藥復方作用機制等具有重要意義。
中醫藥以整體觀念、辨證論治指導臨床實踐，通過多途徑、多靶點、多通路作用于人體，類器官以客觀化、可視化、精準化為特點，應用干細胞，在體外構建了類似體內的組織器官模型，在模擬疾病發生發展、藥物有效性篩選及新藥研發、器官移植和再生醫學等多個領域取得了突破。
類器官能再現體內微環境，評價藥效、實時檢測指標變化、發現潛在標靶及通路，同步進行作用機制的探索和驗證，這與中醫藥整體觀念、多靶點作用不謀而合，更能體現中醫藥從整體觀診療的特色?，F階段，類器官生物庫的建立為優化中藥組方，預測中藥在人體的不良反應，指導中醫藥精準治療提供了新的方式，不僅能夠用于某一病證組方的評價和優化，也是個體患者進行精準醫療的最佳模型。
2. 類器官在乳腺腫瘤的中醫藥研究中的作用
類器官在乳腺腫瘤的中醫藥研究中也有著重要作用。Koval等發現喀麥隆桃金娘科植物水桃在乳腺癌類器官中有強大的活性，通過對Wnt通路的抑制調節癌癥細胞；Phan等在乳腺癌類器官模型下發現，香味草提取物可通過缺氧激活化療藥物對乳腺癌的治療效果；Ye等發現白藜蘆醇通過對乳腺癌類器官STAT3的激活抑制乳腺癌細胞的增殖；Zhang等發現，天然產物駱駝蓬堿（Harmine，HM）的先導化合物YH677通過調控TGFβ/Smad信號通路抑制CSCs的擴增，在PDO模型中通過劑量依賴抑制TNBC/EMT進程，發揮對TNBC生長和轉移的抑制作用；
Liu等發現一種天然的CRM1小分子拮抗劑——傳統草藥蘿卜的主要活性成分蘿卜硫素，作為一種高效小分子拮抗劑在乳腺癌類器官中通過抑制STAT3信號通路對乳腺癌干細胞具有顯著的活性，同時保護正常乳腺組織細胞；Lin等通過乳腺癌類器官模型發現，黃柏分離得到的一種天然黃連素型生物堿奧帕馬汀通過對PI3K/AKT、MAPK、VEGFA-VEGFR2通路的干預影響乳腺癌發展的進程；
Shan等發現，藥用真菌纖孔菌屬的乙醇提取物三萜類化合物通過對乳腺癌類器官JAK2/STAT3信號軸的抑制，起到抗乳腺癌活性的作用；Deng等通過黃芪的有效活性分子環黃芪醇（Cycloastragenol，CAG）干預惡性腫瘤PDO發現，CAG聯合PD-1抗體增強了類器官中CD8+T細胞的殺瘤能力；
Xu等通過對惡性腫瘤的基因小鼠模型及PDO模型中添加傳統草藥白術的小分子化合物白術內酯1（Atractylenolide，ATT-1）發現，ATT-1能夠增強免疫蛋白酶體活性，促進腫瘤抗原呈遞給CD8+T細胞并提高基于抗PD-1的免疫療法的功效；雷公藤酚（Celastrol，CEL）是分離自雷公藤的一種天然五環三萜類化合物，CEL通過對STAT3的抑制，抑制腫瘤類器官的活性，起到強效抗腫瘤作用，CEL有可能成為癌癥治療中有前途的STAT3抑制劑。
Fan等使用心臟肥大的類器官模型評估了中藥提取物冠心寧注射液的機制和藥效學影響。Chen等建立腸道類器官并表明，甘草次酸增加人抗原R和下游增殖相關核抗原Ki67的水平，以促進腸道類器官的發育并維持腸道穩態。結直腸癌類器官的建立，篩選出雷公藤酚抑制類器官生長，強于陽性藥物L-OHP。
中醫藥治療和類器官在個體化精準治療上理念一致，且中醫藥種類繁多，為類器官研究提供了豐富的選擇。
05、結語
有效模擬細胞功能和疾病對臨床醫學研究至關重要。類器官是一個值得期待的優勢工具，尤其對于惡性腫瘤類疾病的幫助遠大于二維細胞系及PDX。目前，類器官在乳腺癌的發生發展、轉移機制探索上已經取得了可觀的進展，闡明了關鍵基因與細胞在乳腺癌中的作用機制。
但是，類器官在乳腺癌腫瘤微環境中相關的基礎研究仍相對不足，或可做進一步研究，以便更加真實的反應乳腺癌腫瘤微環境在腫瘤發病過程中的病理生理改變，目前抗腫瘤的標準治療是針對癌細胞，通過對腫瘤微環境的研究有助于腫瘤治療的進一步完善，起到直接針對腫瘤微環境中受調節的細胞群的作用，為臨床藥物治療及新藥開發提供新思路；在臨床中對于乳腺癌抗腫瘤藥物的篩選、新藥開發、療效的評價、毒性的甄別也有著廣泛的應用，反饋于臨床患者，促進腫瘤患者腫瘤的消散、減輕手術風險的發生、減少術后復發轉移的可能、有效延長了患者的生存期。
在中草藥方面，乳腺癌類器官的研究較為缺乏，中藥單體及有效成分仍停留在對于乳腺癌腫瘤類器官的腫瘤殺傷作用，后續的研究可以著眼于對通路的阻斷、機制的調節、蛋白合成的干預；中藥含藥血清、中藥凍干粉、中藥藥對及復方作為中醫腫瘤體外干預方法，目前在乳腺癌相關的類器官中尚未見較為系統的研究，或可為中藥干預乳腺癌類器官的基礎及臨床研究提供新思路，也可為中藥選方通過客觀依據；不可忽視的是，類器官實驗中的中藥劑量和給藥方式也需進一步驗證，為后期研究工作的開展提供借鑒。
在中醫藥方面，乳腺癌類器官的研究尚處于起步階段，相關研究相對不足，可以利用類器官構建更加符合真實世界的BC患者發病的病理生理學的疾病模型，尋找潛在的治療靶點、作用機制及信號通路，為中醫藥防治乳腺癌提供更加真實的實驗數據，加快中醫藥防治乳腺癌的研究。
中醫對于乳腺病的診療強調臟腑內外、表里之間的聯系，從沖任入手，診療乳腺的同時兼顧于整體調節，這與西醫學中的激素調節軸：甲狀腺-乳腺-子宮軸相互貼合，也為中醫的“辨證論治”提供科學依據，或可在乳腺癌的中醫證候特征和機制研究中發揮重要作用。
類器官的根本仍是體外模型，缺乏在人體內時的血管、神經、免疫系統及其相互間的聯系，而乳腺癌的中醫證候是乳腺腫瘤發展到某個階段病因、病位、病勢、邪正關系等一系列病理變化的總稱，是在中醫“整體觀念”指導下的一種概括，二者本質上存在差異，同時對于中醫藥改善免疫功能的研究，單獨的類器官構建也是無法模擬機體的免疫狀態。因此，結合類器官芯片技術構建、模仿激素調節軸，模擬乳腺癌狀態下的機體生理病理功能及免疫反應，結合中醫整體觀念指導臨床診療，為整體評價中醫藥治療乳腺癌的科學性提供了可能。
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