編者按
淫羊藿(Epimedii Folium)是中國傳統中藥, 具有很高的藥用價值，可用于類風濕關節炎、骨質疏松、白癜風、腫瘤、生殖及免疫系統疾病等研究與臨床治療。
通過斑馬魚模型，研究人員可以全面、快速地評估淫羊藿的活性成分、藥效、毒性及代謝過程，為淫羊藿的深入研究和開發提供了有力的支持。本期我們分享近期發表的幾篇基于斑馬魚模型開展中藥淫羊藿研究的最新成果~~~
01、利用斑馬魚等揭示治療白癜風常用中藥淫羊藿促進色素合成作用的分子機制和藥效物質
文章題目
Epimedin B exhibits pigmentation by increasing tyrosinase family proteins expression, activity, and stability
雜志：Journal of Pharmaceutical Analysis（IF=8.8）
發表時間：2024年1月
作者：李醫明、吳華麗團隊
單位：上海中醫藥大學中藥學院等
文章主題：
近年來，白癜風的臨床治療主要集中在抑制自身免疫反應和促進色素合成兩方面。中藥淫羊藿中的主要活性成分朝霍定B（EB）在免疫調節方面已有報道，而對黑素細胞的色素合成過程的影響尚未研究報道。
因此，研究團隊對EB促進色素合成的過程進行了系統性的體內外探討，包括細胞模型（黑色素瘤細胞、人原代黑色素細胞）、人皮膚組織培養模型、模式動物斑馬魚色素脫失模型和C57BL/6小鼠色素脫失模型等。首先確定了朝藿定B（EB）是淫羊藿提取物中含量高、活性強、毒性低的主要活性成份，并在細胞、組織、斑馬魚、小鼠多層面對EB體內外調控色素方面進行深入系統的研究。
采用RNA-Sequencing、激光共聚焦、CO-IP和Proximity Ligation Assay（PLA）鄰位連接等實驗手段闡明EB通過增加酪氨酸酶（TYRs）轉錄翻譯和促進TYR活性；同時EB可以逆轉TYR和TYRP1（大約60 kDa）的泛素化-蛋白酶體的降解過程，而對DCT沒有影響，從而達到增強TYRs蛋白的穩定性多種分子機制來發揮作用。
該研究首次對EB在色素合成藥理活性進行了探究，并通過體內外多種色素脫失模型上評估EB色素合成作用，發現EB從表達、活性和穩定性三方面靶向TYRs，從而發揮色素合成作用，從而初步闡明了臨床治療白癜風常用中藥淫羊藿促進色素合成作用的分子機制和藥效物質基礎。這一研究成果從分子水平揭示淫羊藿臨床治療白癜風的藥效物質基礎，為白癜風的新藥開發奠定基礎。
圖1 EB可靶向TYRs發揮色素合成作用
02、基于斑馬魚揭示中藥復方強心飲防治腎上腺素誘導心肌肥厚機制
文章題目
Qiangxinyin formula protects against isoproterenol- induced cardiac hypertrophy
雜志：Phytomedicine (IF=6.7)
發表時間：2024年4月
作者：周忠焱、馬杰、唐靖一、汪玉等
單位：上海中醫藥大學附屬龍華醫院、香港大學等
文章主題：
心肌肥厚和炎癥、心纖維化同屬于心肌梗死性心力衰竭（HF）的重要特征，心血管疾病是目前老齡化死亡的主要原因，心力衰竭屬于其中最典型的一種高度危及生命的心血管疾病。中藥復方強心飲（QXY），源自《傷寒論》中所記載的真武湯，由附子、白術、淫羊藿、豬苓、補骨脂、白芍、川芎、茯苓、鹿角9種中藥組成，已有實驗證明QXY抑制氧化應激和心肌細胞的凋亡，改善慢性心力衰竭患者的心功能狀況。
本研究通過多組學分析研究，探究中藥復方強心飲的組方中成分表征和藥效驗證。使用UHPLC-MS將QXY的化學成分量化，運用斑馬魚建立異丙腎上腺素（ISO）誘導的心肌肥大模型，驗證QXY顯著治療心功能障礙和損傷的作用及作用機制。結果發現強心飲中含有烏頭原堿（BMA）、白術內酯I（ATL I）、淫羊藿苷（ICA）、槲皮素（QUE）、補骨脂素（PRN）、山奈酚（KMP）、阿魏酸（FA）、原兒茶酸（PCA）等多種活性成分，其中淫羊藿苷（ICA）、補骨脂素（PRN）和阿魏酸(FA)的含量尤為豐富。
在斑馬魚模型上，發現強心飲顯著緩解ISO引起的心肌損傷指標BNP、CKMB、CTNT2升高，并且轉錄組數據提示其作用機制與鈣離子信號有關。在大鼠心肌細胞H9c2模型上，強心飲能夠增加SMAD2和MYPT1的磷酸化表達，抑制MLC的磷酸化表達，并阻斷鈣內流、減少細胞內脂質過氧化產物MDA、刺激ATP的產生、增加線粒體膜電位，從而抑制ISO誘導的心肌細胞肥大。
圖2 QXY對ISO誘導的斑馬魚心肌肥大及改善心臟損傷標志物的mRNA表達水平
03、基于斑馬魚評價箭葉淫羊藿的代謝-效/毒作用
文章題目
基于斑馬魚M-Act/Tox聯合評價箭葉淫羊藿的代謝-效/毒作用
雜志：中草藥（北大核心期刊，2019年第7期）
發表時間：2019年4月
作者：葛靜、凌潔、寧青、劉欣欣、宋捷、韋英杰、賈曉斌
單位：南京中醫藥大學第三臨床醫學院、江蘇省中醫藥研究院國家中醫藥管理局中藥釋藥系統重點研究室、中國藥科大學中藥學院
文章主題：
針對現有體內、外模型無法進行M-Act/Tox聯合的在體、高效篩選的技術瓶頸，本課題組依據斑馬魚的遺傳發育與哺乳動物高度相似的特點及優勢，參考前期相關研究及國內外文獻，提出斑馬魚代謝模型、骨質疏松模型及毒性評價法有機整合，可建立M-Act/Tox聯合的抗骨質疏松中藥高效篩選法。對實現兼顧有效性與安全性，實現條件簡單、高效率、低成本、高靈敏地進行中藥在體M-Act/Tox聯合評價具有重要意義。本研究采用提出的斑馬魚M-Act/Tox聯合法，評價箭葉淫羊藿的安全性、抗骨質疏松有效性及代謝特性，以期為深入研究其毒/效物質基礎提供參考。
斑馬魚毒性評價發現，箭葉淫羊藿在500 μg/mL及以上質量濃度時致斑馬魚中毒（臟器變形或死亡），毒性與給藥質量濃度和時間相關。潑尼松龍誘導的斑馬魚骨質疏松模型評價發現，低質量濃度箭葉淫羊藿（6.25、12.50、25.00 μg/mL）具有明顯的抗潑尼松龍誘導斑馬魚骨丟失作用，而在較高質量濃度（100、200 μg/mL）時抗骨質疏松作用則受到抑制，這為安全、有效地使用淫羊藿提供參考。
斑馬魚代謝實驗發現，箭葉淫羊藿中主要多糖基黃酮成分EA、EB、EC和淫羊藿苷經斑馬魚作用24 h后，全部脫糖基轉化為含有2個鼠李糖基的SC和1個鼠李糖基的BI，而SC和BI相對穩定，提示代謝物可能是潛在致毒/致效的關鍵因素，在前期研究中發現多糖苷EA、EB和淫羊藿苷對斑馬魚的毒性小，以淫羊藿苷為代表，發現其給予斑馬魚后動態轉化為BI，但未見斑馬魚產生毒性；而EC給予斑馬魚后，動態轉化為箭藿苷C后毒性增加。本研究亦提示斑馬魚的效應/毒性評價是基于代謝轉化的在體過程。
斑馬魚M-Act/Tox聯合評價法突破了現有體內、外模型無法兼顧三者在體與高效評價的技術瓶頸，具有樣品用量小、勞動強度小、高效率、低成本、在體化、微板化等優點，為高效辯識壯骨中藥的M-Act/Tox提供思路與方法。
圖3 斑馬魚幼魚(8 dpf)頭骨茜素紅染色顯微成像圖(X100)
04、基于斑馬魚構建抗骨質疏松的小分子藥物篩選模型
文章題目
Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis
chemical screening
雜志：Animal Models and Experimental Medicine (AMEM)
發表時間：2018年4月19日
作者：張晶晶、黃洪新等
單位：廣東醫科大學附屬醫院等
文章主題：
本研究利用成骨細胞表達綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚Tg(ola.sp7:nlsGFP)，結合經典的糖皮質激素地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導方法建立了骨質疏松斑馬魚模型的研究成果。通過檢測成骨細胞綠色熒光蛋白eGFP的信號面積與強度，來反映骨礦化面積及骨密度情況，并與傳統化學染色方法進行了對比。結果證明，利用轉基因斑馬魚品系構建的骨質疏松模型來間接反映成骨細胞密度等的方法便捷、可行、有效，與傳統斑馬魚骨骼化學染色方法相比，更加穩定、省時、高效，可作為抗骨質疏松藥物高通量篩選模型。
利用淫羊藿黃酮等治療誘導的骨質疏松斑馬魚后，成骨細胞密度等得到拯救恢復。進一步基因水平的研究表明，糖皮質激素誘導斑馬魚骨質疏松模型主要由于其抑制了成骨細胞相關因子osterix, osteocalcin和 osteopontin的表達，上調了破骨細胞相關基因tartrate-resistant acid phosphatase等的表達。而淫羊藿黃酮的治療能重新拯救恢復osterix, osteocalcin和 osteopontin等的表達水平。
該項研究成果以轉基因斑馬魚為工具，結合經典的骨質疏松動物模型構建方法，為抗骨質疏松藥物分子的高通量篩選和骨質疏松病理機制的研究提供了便捷、可靠的動物研究模型。
圖4 構建斑馬魚骨質疏松模型
05、淫羊藿及其制劑主要化學成分與肝損傷作用研究進展
文章題目
淫羊藿及其制劑主要化學成分與肝損傷作用研究進展
雜志：中草藥（北大核心期刊，2023年第21期）
發表時間：2023年11月
作者：張悅，王佳藝，劉慧敏，殷宏慶，宋麗麗，李遇伯等
單位：天津中醫藥大學中藥學院等
文章主題：
近年來，有關淫羊藿及其復方制劑致肝損傷或引起不良反應的報道逐年增多。本文通過對淫羊藿及其2種制劑的化學成分及肝損傷研究進行全面歸納總結，為淫羊藿及其相關制劑的安全性研究提供參考，同時為其臨床安全用藥提供思路和支持。
以箭藿苷B為例，目前的研究表明，箭藿苷B可導致斑馬魚胚胎卵黃囊腫脹和吸收延遲，存在發育毒性，并且在低濃度的條件下仍可引起成年斑馬魚細胞壞死，中度水腫及輕度空泡改變，但是對于其毒性作用的機制還未有研究進行詳細的闡明。
多項研究證明，淫羊藿、壯骨關節丸和仙靈骨葆膠囊長時間大量給藥后，可引發肝損傷，其相關的毒性機制可能與膽汁酸代謝受阻、肝細胞凋亡及鐵死亡、細胞結構受損，氧化應激增加等生物學過程相關。環特生物郭勝亞等基于斑馬魚評價壯骨關節丸的肝臟毒性，結果表明壯骨關節丸導致斑馬魚卵黃囊吸收延遲，誘發斑馬魚肝臟毒性。時克等用斑馬魚毒/效同步法評價壯骨關節丸對健康魚和骨質疏松模型魚的毒性作用，結果顯示，壯骨關節丸對模型斑馬魚的毒性更強。并且有多項研究表明，淫羊藿中黃酮類成分朝藿定C的代謝產物為箭藿苷C，箭藿苷C的動態增加與淫羊藿毒性產生密切相關。
除固有毒性成分引發肝損傷外，以激活NLRP3炎癥小體活性的淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II還可以誘發特異質肝損傷。研究表明，脂多糖可刺激機體產生免疫反應，在免疫激活的狀態下，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II可促進NLRP3炎癥小體活化，導致促炎因子的釋放、細胞焦亡的發生，從而誘發特異質肝損傷。
為減少肝損傷事件的發生，使淫羊藿及其制劑更合理、更安全的應用于臨床，進一步對以上2種形式的肝損傷進行總結，見圖5。首先需要警惕由長期、大劑量用藥造成的固有肝毒性。其次，處于免疫應激狀態下的患者，為淫羊藿及其制劑致肝毒性的主要易感人群，此類患者應盡量避免使用淫羊藿及其制劑，降低特異質肝毒性發生的風險。
圖5 淫羊藿及其復方制劑引起肝損傷推斷圖
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型及腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！17364531293（微信同號）