編者按
近年來，乳酸化（Lactylation）作為一種新型蛋白質翻譯后的修飾方式，在細胞代謝、基因表達、疾病發展、蛋白質功能、腫瘤微環境中發揮著重要作用，通過斑馬魚、基因編輯等技術深入研究乳酸化修飾的機制和功能，有望為疾病的治療和藥物研發提供新的思路和方法。
9月25日，浙江大學張龍教授研究團隊發表在Nature雜志上最新研究揭示了乳酸化修飾調控先天性免疫新機制。無獨有偶，越來越多的研究者利用斑馬魚在乳酸化研究中取得了顯著進展，本期我們分享近期發表的幾篇基于斑馬魚模型開展乳酸化作用機制研究的高分成果~~~
01、利用斑馬魚等揭示乳酸化驅動的FTO靶向CDK2加重糖尿病視網膜病變微血管異常
文章題目
Lactylation-driven FTO targets CDK2 to aggravate microvascular anomalies in diabetic retinopathy
雜志：EMBO Molecular Medicine（IF=11.1，一區）
發表時間：2024年1月31日
作者：劉慶淮、陳雪等
單位：南京醫科大學等
文章主題：
糖尿病視網膜病變( diabetic retinopathy，DR )是工作年齡人群不可逆視力喪失的主要原因。肥胖相關蛋白（FTO）是一種N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，可使參與能量穩態的RNA去甲基化，但其對DR的影響尚未深入研究。
本研究中，增殖性DR患者的玻璃體纖維血管膜中FTO表達升高，FTO可促進內皮細胞( endothelial cells，ECs )的細胞周期進程和尖端細胞形成，從而在斑馬魚、小鼠體內促進血管生成；也可以通過調節EC-周細胞的相互作用，觸發糖尿病微血管滲漏，并介導EC-小膠質細胞的相互作用，在體內和體外誘導視網膜炎癥和神經退行性變。
在機制上，FTO通過m6A-YTHDF2依賴性方式調節CDK2 mRNA的穩定性，進而影響內皮細胞特性。糖尿病條件下，FTO上調是由乳酸介導的組蛋白乳酸化驅動的。FB23-2是FTO m6A去甲基化酶活性抑制劑，可抑制體外血管生成表型。為實現全身給藥，研究人員開發了一種封裝FB23-2的納米平臺，并證實其在小鼠體內的靶向性和治療效率。綜上所述，本研究表明FTO對DR中的內皮細胞功能和視網膜穩態至關重要，并可作為DR患者的治療靶點開展進一步研究。
圖1
在斑馬魚模型中，研究人員分析了FTO對血管功能的調節作用。在活的轉基因斑馬魚株Tg(LR57:GFP)中，通過胚胎注射斑馬魚FTO mRNA過表達FTO，該菌株含有增強的綠色熒光蛋白(EGFP) cDNA，在fli1啟動子的控制下，從而使研究人員能夠可視化其全身血管，包括眼部血管。注射濃度為120 ng/µL的FTO mRNA的斑馬魚胚胎沒有出現明顯的全身變化，在受精后48 h收集并檢查(圖1H, 1)。
為了研究FTO在糖尿病條件下的作用，在添加3%葡萄糖的水中培養魚。熒光染色檢測到，與未注射3%葡萄糖水的斑馬魚和對照組相比，注射FTO mRNA并在3%葡萄糖水中維持的斑馬魚的密度增強，眼部血管擴張(圖3J)。這些數據表明，FTO促進糖尿病條件下斑馬魚的眼部血管化。總的來說，研究人員發現FTO調節內皮尖端細胞的形成，促進斑馬魚的新血管形成。
圖2
02、利用斑馬魚揭示PKM2乳酸化修飾代謝調控機制
文章題目
Lactylation of PKM2 Suppresses Inflammatory Metabolic Adaptation in Pro-inflammatory Macrophages
雜志：International Journal of Biological Sciences (IF=10.7)
發表時間：2022;18(16):6210-6225.
作者：章雄、劉琰等
單位：上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院等
文章主題：
乳酸是重要的表觀遺傳調控分子，它可以通過組蛋白乳酸化修飾作用，調控巨噬細胞極化相關基因的表達。最新證據表明，代謝適應是巨噬細胞表型轉變的重要標志和先決條件。PKM2作為骨髓來源的巨噬細胞 (BMDM) 的主要丙酮酸激酶亞型，其調節糖酵解過程和乳酸產生機制研究尚不清楚。
本研究中，研究人員利用斑馬魚等首次發現PKM2是乳酸化修飾的底物之一，揭示了乳酸介導的PKM2乳酸化修飾可增加PKM2的丙酮酸激酶活性以抑制Warburg效應，最終促進巨噬細胞從促炎表型向修復表型的轉變，闡明了PKM2的乳酸化修飾在調節促炎巨噬細胞炎癥代謝適應中的潛在作用。
為了探究乳酸激活PKM2的機制，研究人員在LPS誘導的BMDM細胞模型中，用PKM2抗體進行IP實驗，并使用乳酸化泛抗體檢測PKM2的乳酸化水平，發現乳酸處理上調了PKM2的乳酸化水平，隨后通過IP-質譜分析找到了四個PKM2的乳酸化修飾位點 (K62，K188，K224和K337)，其中K62R位點突變顯著降低了PKM2乳酸化水平，其余3個位點突變對乳酸化水平無顯著改變，這表明K62位點是PKM2的主要乳酸化位點，且K62位點在斑馬魚和許多哺乳動物中進化保守。因此，乳酸通過介導PKM2 K62位點的乳酸化水平增加其丙酮酸激酶活性，進而促進巨噬細胞向修復表型的轉變。
圖1
03、利用斑馬魚等揭示二甲雙胍以H3K18乳酸化減少中性粒細胞募集
文章題目
Metformin Attenuates Neutrophil Recruitment through the H3K18 Lactylation/Reactive Oxygen Species Pathway in Zebrafish
雜志：Antioxidants (IF=7.6)
發表時間：2024年1月30日
作者：任大龍、殷宗俊等
單位：安徽農業大學動物科技學院等
文章主題：
二甲雙胍(Metformin, Met)，作為一種眾所周知的的口服降糖藥，不僅能降低胰島素抵抗和肝臟葡萄糖的產生，還能調節免疫反應，抑制巨噬細胞、淋巴細胞的細胞因子產生以及NF-κB信號通路，而且，對促進調節性T細胞的增殖、調節過度活躍的免疫反應至關重要，但二甲雙胍對中性粒細胞炎癥行為的具體影響尚不清楚。
本研究中，利用斑馬魚炎癥模型，探究了二甲雙胍對中性粒細胞募集的影響及其潛在機制，強調了表觀遺傳調節在炎癥中的關鍵作用，揭示了二甲雙胍在治療炎癥相關疾病方面的潛力。實驗結果表明，乳酸通過提高活性氧的水平來影響中性粒細胞的遷移，二甲雙胍降低組蛋白(H3K18)乳酸化引起的氧化應激和炎癥，為乳酸鹽在免疫調節和炎癥中的作用提供了重要的見解。
為了探究二甲雙胍下調H3K18乳酸化，研究人員在斑馬魚實驗中對二甲雙胍的功能進行了深入研究，特別是在調節細胞乳酸生成中的作用，并驗證了乳酸含量和基因表達，如hdac3，pkma, gapdh等。結果表明，經二甲雙胍處理后，乳酸濃度顯著降低( 圖1a)，表明二甲雙胍對乳酸水平有調節作用；并觀察到hdac3、pkma和gapdh基因表達水平的變化，二甲雙胍治療下調了它們的表達(圖1b-d)。這些基因在乳酸代謝中起著至關重要的作用，其下調暗示著對乳酸代謝率的潛在影響，表明二甲雙胍可能通過影響這些乳酸酶相關基因的表達來調節乳酸代謝。
在蛋白水平上，通過檢測斑馬魚組蛋白的泌乳水平，發現二甲雙胍顯著下調了H3組蛋白的泌乳修飾，尤其是H3K18位點( 圖1e–g)。結合斑馬魚和細胞實驗的結果表明，二甲雙胍影響斑馬魚中乳酸酶相關基因，并下調組蛋白乳酸化。
圖1
此外，研究人員還發現H3K18乳酸化通過增加活性氧水平，來影響中性粒細胞募集。與對照組相比，乳酸組總體乳酸化水平、H3K18乳酸化水平顯著升高(圖2a-c)，而當乳酸和二甲雙胍聯合使用時，乳酸誘導的上調被有效抑制；乳酸顯著提高了 pkma和 gapdh基因( 圖2d, e)，而在同時使用乳酸和二甲雙胍組中，這些基因的表達明顯受到抑制，進一步證明了二甲雙胍調節乳酸化修飾的能力。乳酸不僅增加了斑馬魚體內活性氧的產生( 圖6f,g)，也顯著上調氧化應激相關基因的表達 duox和 sod1。這些結果表明，乳酸可能通過激活氧化應激途徑來調節活性氧的產生。
通過急性炎癥模型發現，在斑馬魚乳酸處理后，乳酸組均表現出中性粒細胞的顯著增加，二甲雙胍的加入削弱了中性粒細胞的遷移，從而減少了體內的炎癥反應( 圖2j-q)。這些發現與之前活性氧水平升高的研究結果一致，表明乳酸可能通過上調活性氧水平來影響中性粒細胞的遷移行為。
圖2
04、利用斑馬魚等揭示Vps34乳酸化促進自噬調控機制
文章題目
ULK1-mediated metabolic reprogramming Regulates Vps34 Lipid Kinase Activity by its lactylation
雜志：Science Advances（IF=13.6）
發表時間：2023年6月2日
作者：程俠衛等
單位：華東理工大學藥學院等
文章主題：
自噬和糖酵解是高度保守的生物過程，涉及生理和病理細胞程序，有研究表明，磷酸化、乙?；?、泛素化修飾等PTM會影響自噬核心蛋白分子的結構、活性以及功能。ULK1作為參與自噬早期至晚期的最關鍵的蛋白激酶，ULK1介導的代謝重編程是否通過其乳?；{節Vps34脂質激酶活性？乳酸介導的乳酸化是否參與調節自噬機制？目前還知之甚少。
本研究中，研究人員利用斑馬魚等闡述了自噬調控機制，進而將細胞自噬與糖酵解結合起來。研究發現，糖酵解酶乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）在營養缺少時在UNC-51樣激酶1（UNC-51–like kinase 1，ULK1）激活時被激活。具體來說，ULK1直接與LDHA相互作用，在營養稀缺時磷酸化絲氨酸-196并促進乳酸的產生。乳酸通過 Vps34 乳化作用（賴氨酸-356 和賴氨酸-781）將自噬和糖酵解連接起來，這種作用由?；D移酶 KAT5/TIP60 介導。Vps34 乳?；鰪娏?Vps34 與 Beclin1、Atg14L 和 UVRAG 的結合，進而提高了 Vps34 脂質激酶的活性。Vps34 乳酸化可促進自噬通量和溶酶體內轉運。劇烈運動時骨骼肌中的Vps34 乳酸化，以維持肌肉細胞的平衡，并通過誘導細胞自噬與癌癥進展相關。
值得注意的是，LDHAS196是一種保守的殘留物，從斑馬魚到人類，并且在LDHA空間結構的基礎上，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）質子受體中靠近組氨酸位點的環域中發現了這種殘基。因此，研究人員推測絲氨酸-196處LDHA的磷酸化引起了環結構的構象變化，有利于組氨酸殘基與NADH的相互作用。
圖1
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型及腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！