編者按

 近年來，人們一直在努力揭示適應性免疫在腫瘤免疫監視/逃避/抑制中的作用，并將其轉化為有廣闊前景的新型免疫療法。有研究人員優化了斑馬魚患者來源的異種移植物（zPDXs）——“zAvatars”，用于個性化醫療。該檢測方法是將標記的腫瘤細胞注射到斑馬魚胚胎中，在4天內評估腫瘤行為和治療反應。盡管只有先天免疫是活躍的，但研究人員觀察到腫瘤移植存在一些異質性。研究人員假設斑馬魚的先天免疫系統可以受到腫瘤的調節，而腫瘤本身能夠產生免疫抑制性TME或被消除。

今天，我們分享2021年2月19日由葡萄牙尚帕利莫基金會(Champalimaud Foundation)研究團隊在《Nature Communications》雜志上發表的最新研究，該研究結合使用了斑馬魚單克隆和多克隆異種移植、“zAvatars”、斑馬魚突變體和轉基因、小鼠異種移植物、再移植實驗和單細胞轉錄組學來檢驗這一假設。

文章題目

Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model

雜志：Nature Communications（IF=16.6）

發表時間：2021年2月19日

作者：Póvoa, V., Rebelo de Almeida, C., Maia-Gil, M. et al.

單位：葡萄牙尚帕利莫基金會(Champalimaud Foundation)等

01、研究背景

近年來，人們一直在努力揭示適應性免疫在腫瘤免疫監視/逃避/抑制中的作用，并將其轉化為有廣闊前景的新型免疫療法。免疫檢查點療法旨在清除腫瘤微環境（TME）中阻礙抗腫瘤T細胞反應的抑制途徑。然而，由于腫瘤細胞沒有表達足夠的新抗原（免疫原性不夠），治療可能會失敗。另一個主要障礙可能是由基質和各種免疫細胞如調節性T細胞（Treg）、髓樣衍生抑制細胞（MDSC）、替代性活化的促腫瘤巨噬細胞（“M2樣”）和中性粒細胞（“N2樣”）組成的抑制性（冷）TME的預先存在，可能會阻斷抗腫瘤免疫反應。事實上，先天性骨髓來源細胞實際上代表了大多數實體瘤[2, 4]中TME的主要成分，往往超過淋巴細胞甚至腫瘤細胞本身。這些免疫系統群體存在于所有組織中。然而，人們對它們在癌癥誘導的免疫抑制和免疫療法中的作用的探索和了解仍然較少。越來越多的證據表明，先天免疫細胞具有重要的抗腫瘤和促腫瘤作用。重要的是，先天性促腫瘤狀態是高度動態的，可以有選擇性地逆轉，為新的更有效的治療方法提供了可能。

斑馬魚模型已成為研究腫瘤生物學及其與免疫系統相互作用的有力工具。斑馬魚具有高度保守的脊椎動物先天免疫系統，包括補體、Toll樣受體、中性粒細胞和具有吞噬活性的巨噬細胞。另外其適應性免疫的完全成熟僅發生在受精后2-3周。這為研究獨立于適應性系統的體內先天性免疫反應提供了時間窗口。此外，斑馬魚的透明性使細胞與細胞間的相互作用可以達到前所未有的實時成像，并且基因的可操作性使報告基因系和突變體的工程化成為可能。

近來，研究人員優化了斑馬魚患者來源的異種移植物（zPDXs）——“zAvatars”，用于個性化醫療。該檢測方法是將標記的腫瘤細胞注射到斑馬魚胚胎中，在4天內評估腫瘤行為和治療反應。盡管只有先天免疫是活躍的，但研究人員觀察到腫瘤移植存在一些異質性。研究人員假設斑馬魚的先天免疫系統可以受到腫瘤的調節，而腫瘤本身能夠產生免疫抑制性TME或被消除。在本研究中，研究人員結合使用了斑馬魚單克隆和多克隆異種移植、“zAvatars”、斑馬魚突變體和轉基因、小鼠異種移植物、再移植實驗和單細胞轉錄組學來檢驗這一假設。

02、研究成果

1.  斑馬魚異種移植顯示出不同的移植特征

研究人員使用斑馬魚異種移植模型研究了多種人類乳腺和結直腸癌細胞系的移植效率。在4 dpi時，發現不同的癌細胞系在斑馬魚異種移植物中表現出不同的移植特征。將移植描述為在4 dpi時出現腫瘤（至少30個腫瘤細胞）的異種移植物的頻率，將清除描述為移植抑制。根據Schreiber命名法[13]將具有較高的移植率（超過80%）的腫瘤定義為“增殖者”，將移植率較差（20-30%）的腫瘤定義為“抑制者”（圖1a）。

然而研究人員觀察到來自同一患者不同腫瘤進展階段的癌細胞之間的移植物特征存在差異。源自原發腫瘤的SW480細胞呈現出“移植抑制”，但6個月后從淋巴結轉移中分離出的SW620細胞則顯示出“移植增殖”（圖1a）。這兩種腫瘤細胞之間的移植率差異最初也是在小鼠異種移植物中報道的。

此外，自相矛盾的是，研究人員觀察到SW480_regressor在接受化療/放療后可能會增加其移植率，這也可以在患者衍生的zAvatars中觀察到（圖1b）。鑒于化療/放療可能會引起免疫抑制效應，推測這可能會降低斑馬魚宿主的抗腫瘤反應，而這正是“抑制”行為的起因。

圖1

2.  SW480和SW620異種移植物之間的轉錄組分析

接下來，研究人員對SW480_regressors和SW620_progressors進行了一般性轉錄組分析比較。將SW480和SW620腫瘤在2 dpi時從斑馬魚異種移植物中分離出來。從至少三個獨立實驗中收集了大約30個腫瘤用于RNA提?。▓D1c）。對來自相同實驗的剩余異種移植物進行跟蹤直至4 dpi，以確定最終的移植率。僅使用實驗中的RNA樣本，其中SW480移植率低于約30%，SW620移植率高于90%。

差異表達分析顯示，兩種類型的異種移植物之間有459個DEGs（圖1d）?；蚣患治霭l現，富集的基因主要集中在三個生物過程中：免疫反應、代謝和信號傳導（圖1e，f）。參與上皮向間充質轉化（EMT）的基因在SW480異種移植物中特別富集，而參與增殖和缺氧/血管生成的基因在SW620腫瘤中特別明顯（圖1e，f）。

富集分析與之前的研究結果一致，SW480顯示出更強的轉移潛力，而SW620則顯示出更強的血管招募能力。在SW480富集的DEGs中還發現了幾種與免疫相關的通路，尤其是那些參與移植物抗宿主疾病、IL6信號轉導和異體移植排斥反應的通路。相比之下，SW620 DEGs的特點是富集于IFN和TNF信號、ROS和NOTCH通路，但不富集于移植物抗宿主病或同種異體排斥通路（圖1e、f）。

這些結果表明，SW480腫瘤表達了可能刺激清除的信號，而SW620腫瘤則降低了排斥相關通路的活性。

3.  增殖者能夠保護抑制者不被清除

為了測試增殖者是否能夠誘導抑制環境，從而避免抑制者被清除，將SW620_progressors（標記為綠色熒光）與SW480_regressors（標記為紅色熒光）1:1混合，從而在體內產生多克隆異種移植物（圖2a，b）。在三種條件下進行平行測試-單獨測試SW480（紅色）、SW620（綠色）和MIX（SW480+SW620），并在4 dpi時對移植進行量化。

結果表明，SW480細胞的平均移植物率較低，約為20%，大部分腫瘤從斑馬魚體內被清除；而SW620的平均移植物率約為90%。然而，當混合使用時，SW480細胞的移植物率增加了一倍多，達到60%。與此相反，SW620的移植率減少了35%（圖2c）。通過共聚焦顯微鏡分析每個MIX異種移植物中每個克隆的相對比例，結果顯示這兩個群體始終存在，其中SW620是優勢克隆，占腫瘤的70%（圖2d）。而SW480細胞的數量在多克隆異種移植物中有所增加，即SW480從SW620細胞的接近中獲益，這表明SW620細胞可以保護SW480細胞不被清除，并可能提高其生存率（圖2e）。

接下來，研究人員將SW480_regressor與另一個來自不同患者的CRC“增殖者”細胞系HCT116混合移植（圖2f、g）。結果表明，有HCT116存在時，SW480的移植率進一步從20%提高到90%（圖2h），而對每個異種移植物的分析顯示SW480:HCT116的比例為30:70%（圖2i）。同樣，在存在“增殖者”腫瘤細胞的情況下，SW480腫瘤的大小也會增大（圖2j）。

這些結果表明，“抑制者”在“增殖者”的存在下確實會失去其“抑制”特征，而后者可能會產生一種保護性的免疫抑制微。這些結果與小鼠異種移植研究相吻合，后者顯示晚期轉移性腫瘤比原發性腫瘤更有效地參與移植，并具有更強的免疫 抑制作用。

圖2

4.  SW480抑制者TME富含先天性免疫細胞

為了評估“抑制者”和“增殖者”是否能產生不同的腫瘤生態系統，研究人員分析了腫瘤中嗜中性粒細胞和巨噬細胞的存在情況，它們是這一發育階段（受精后2-6天）存在的主要先天性免疫細胞。

將SW480、SW620和MIX腫瘤細胞注射到分別標記有中性粒細胞和大噬菌體的Tg（mpx:eGFP）、Tg（mpeg1:mcherry-F）斑馬魚體內（圖3e、f）。結果表明，與SW620相比，在24 hpi就能檢測到中性粒細胞和巨噬細胞在SW480腫瘤中的募集量明顯增加，這種差異在4 dpi時得到維持和加強（圖3c、d、g、h）。而MIX腫瘤則顯示出與SW620相似的TME，中性粒細胞和巨噬細胞的募集明顯低于SW480腫瘤，表明SW620在MIX中的存在能夠阻止免疫細胞向腫瘤招募。

圖3

5. SW480和SW620腫瘤調節斑馬魚巨噬細胞極化

在TME中，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和中性粒細胞（TANs）可采用抗腫瘤（M1/N1-like）或促腫瘤（M2/N2like）表型。為了研究巨噬細胞在兩種TME中的極化狀態，將SW480和SW620細胞注射到雙轉基因動物Tg（mpeg1:mCherry-F; tnfa:eGFP-F）中，并在1 dpi和4 dpi時對每個細胞群進行分析（圖4a、b）。免疫細胞群的定量分析顯示，自1 dpi起，SW480能夠招募的炎癥細胞數量明顯高于SW620。

此外，對M1樣（TNFa+）與M2樣（TNFa-）巨噬細胞的比例進行分析，可以觀察到SW480 TME在4 dpi時出現了約57%的M1樣巨噬細胞和43%的M2樣巨噬細胞（圖4c、d）。與此形成鮮明對比的是，SW620細胞的TME中，M1樣巨噬細胞與M2樣巨噬細胞的比例分別為35%與65%（圖4c、d）。且從1 dpi到4 dpi，SW620的TME中M2樣巨噬細胞的增加。這一結果表明，SW620細胞可將巨噬細胞極化為M2樣的促腫瘤狀態。此外，從1 dpi到4 dpi，MIX異種移植物再次顯示出與SW620異種移植物相似的動態（圖4c，d）。

總之，這些結果表明，人類腫瘤細胞能夠通過巨噬細胞的極化和隨之而來的吞噬特性調節斑馬魚TME，使其趨向于抗腫瘤或親腫瘤狀態。

圖4

6. 斑馬魚先天性免疫細胞調節SW480清除

上述結果表明，SW620可以保護SW480不被清除，并且SW480細胞能夠更有效地招募先天免疫細胞。此外，MIX異種移植物中SW620數量的增加與SW480移植的增加相關，并且SW620的存在似乎足以減少免疫細胞浸潤。總而言之，這些結果表明先天免疫在清除/植入中發揮著積極作用。

為了直接驗證這一點，研究人員將兩種CRC細胞系注射到中性粒細胞或大噬菌體的轉基因斑馬魚胚胎中（圖5a、b）。結果顯示，中性粒細胞和大噬菌體對SW480細胞的吞噬作用顯著增加（圖5c）。在中性粒細胞斑馬魚中，能夠觀察到移植物顯著增加了3.2倍，而在大噬菌體斑馬魚中，增加了2.8倍（圖5c）。與此相反，中性粒細胞或巨噬細胞的下調對SW620的移植率沒有顯著影響。對腫瘤的定量分析顯示，SW480在巨噬細胞數量減少的panther mutants中體積增大（圖5d）。

總之，研究結果表明，髓系細胞在清除SW480過程中發揮著關鍵作用，而SW620則能夠逃避和/或抑制宿主先天性免疫系統。

圖5

7. SW480清除需要常駐巨噬細胞和定型巨噬細胞

最近的研究表明，常駐巨噬細胞和造血單核細胞衍生巨噬細胞在腫瘤發生中具有不同的功能。在3 dpf的斑馬魚幼體中，巨噬細胞分布于多個外周組織，如大腦、心臟、視網膜和肌肉，以及尾部造血組織（CHT），這是一種短暫的造血組織。研究表明panther mutants的整體造血機能會下降。巨噬細胞數量減少約40%，其遷移也受到影響。然而，組織駐留巨噬細胞（來源于原始造血波和瞬時造血波）比來源于第二單核細胞最終造血波的巨噬細胞（CHT-20%）減少得更多（約60%）。

因此，在panther mutants中觀察到的結果主要反映了常駐巨噬細胞的貢獻。為了進一步研究不同巨噬細胞在腫瘤清除中的作用，使用了脂質體-克洛膦酸鹽來清除大部分巨噬細胞。結果表明，在幾乎完全清除巨噬細胞后，SW480的移植率幾乎達到100%（圖5k），這與panther mutants顯著但不太明顯的移植率增加（圖5c）形成鮮明對比。此外，對腫瘤大小的定量分析也表明，SW480腫瘤大小增加了近2倍（圖5h-j），表現了組織駐留和外周巨噬細胞在腫瘤清除中的重要作用。

8. 小鼠異種移植中表型的保守

盡管斑馬魚由于其與人類之間較高的基因同源性，斑馬魚已成為研究癌癥的相關動物模型。但小鼠仍舊是癌癥和免疫學的金標準模型，研究人員測試了斑馬魚中揭示的表型是否在不同物種間保持一致。SW480、SW620和MIX小鼠異種移植至缺乏成熟B和T細胞的免疫受損小鼠。

然而，與之前的小鼠異種移植物以及我們使用SW480和SW620細胞進行的斑馬魚研究相比，沒有檢測到SW480和SW620在移植能力的主要差異。上述的斑馬魚移植小鼠實驗與之前發表的小鼠研究之間的差異可能是由于使用了不同的品系。

然而，對F4/80+CD80+巨噬細胞的分析表明，SW480腫瘤比SW620或MIX更富含“M1樣”抗腫瘤巨噬細胞群（圖6a-d）。此外，與之前的斑馬魚結果一樣，SW620細胞成為MIX小鼠異種移植物中的優勢克?。▓D6e）。

為了測試小鼠巨噬細胞是否能夠主動調節SW480腫瘤，用L-氯膦酸鹽耗盡巨噬細胞。結果與斑馬魚類似，巨噬細胞耗竭導致腫瘤大小增加（圖6f），這表明巨噬細胞在SW480 TME中的作用在不同物種之間是一致的。

圖6

9. 斑馬魚異種移植中的先天免疫編輯

對移植在斑馬魚的SW480腫瘤進行分析，是否經歷先天免疫編輯從而能夠逃避宿主先天免疫。

在4 dpi時解剖7個SW480腫瘤，實驗結果顯示它們的移植率約為12%。然后將切除的腫瘤在體外擴增三代（圖7a），再將這些腫瘤細胞注射到2 dpf斑馬魚胚胎中。對移植率、腫瘤大小、增殖、凋亡和巨噬細胞浸潤進行量化，并與親代細胞進行比較。結果發現，SW480的接種效率更高（圖7b、c），腫瘤大小也比親本腫瘤增大（圖7d）。但是并沒有檢測到更高的增殖率（圖7e），凋亡水平略有增加（圖7f）。因此，這些結果說明了增殖和凋亡不是移植/清除的主要驅動因素這一觀點。

重要的是，巨噬細胞浸潤在這些腫瘤中明顯減少（圖7g）。這些結果表明，先天性免疫在免疫誘導癌細胞向腫瘤發生方向發展的過程中起著至關重要的作用。

圖7

10. 不同SW480亞克隆的清除和擴增

為了研究可能導致SW480 escapers出現的分子改變，研究人員進行了單細胞轉錄組分析。注射SW480親本細胞（GFP轉染），然后在兩個時間點分離腫瘤，進行單細胞RNA序列分析（圖8a）。解離的單細胞通過熒光激活細胞分選（FACS）被分選到384孔板中，用于scRNAseq：第一個時間點3個板，第二個時間點2個板（圖8a、b）。根據細胞的基因表達譜，使用Seurat對細胞進行匯集和聚類，形成六個不同的細胞簇（細胞狀態），并使用均勻流形近似和投影方法將其可視化（圖8b、c）顯示不同細胞簇之間的基因表達差異。

兩個細胞簇（1號和4號）在短短3天內幾乎消失，而其他細胞簇（0號和2號）則保持其頻率，但也有一些細胞簇（3號和5號）明顯擴大。這些結果表明，一些細胞集群被清除（1和4），而另一些細胞集群能夠躲避先天性免疫檢測，因此得以維持（0、2、3和5）（圖8e）。

在頻率明顯降低的第1組中，富集通路分析表明先天免疫相關通路被激活，如干擾素通路以及幾種炎癥細胞因子（圖8d、e）。眾所周知，這些細胞因子可作為趨化誘導劑吸引大的趨化因子CX3CL1/fractalkine可吸引T細胞和單核細胞，而小的趨化因子CXCL1在炎癥過程中尤其能吸引中性粒細胞。這些趨化因子在亞克隆中的表達增加，降低了在腫瘤中的頻率，可能有助于清除腫瘤。

與此相反，在3中觀察到IL10免疫抑制相關信號的富集，這表明IL10信號可能保護SW480_zEscapers免受清除（圖8d、e）。SW480和SW620細胞以前被歸類為干樣亞型，Wnt信號靶標以及其他干細胞和間充質基因高表達，而分化標志物低表達。

第3組中的Wnt信號似乎非常活躍，各種通路成分（圖8e）的高表達突出表明了這一點。這些基因是該通路的典型下游靶標和效應物。Notch信號除了促進干細胞狀態外，在決定吸收性TA祖細胞（NOTCH_ON）與分泌性TA祖細胞（NOTCH_OFF）之間也至關重要。由于NOTCH-ON集群1大部分被清除，其他不斷擴大的集群是否具有“相反”分泌型命運的標記。有趣的是，擴展后的第5組似乎富集了Tert和Dll4，這表明該組可能代表了被稱為+4的類靜息祖細胞池（圖8e）。

總之，研究結果顯示了表達IFN相關信號傳導和Notch激活的特定回歸者亞克隆的清除，表達IL10抑制途徑的亞克隆的擴展，以及Wnt和分泌樣“狀態”的擴展（簇3），如以及假定的“靜止”樣祖細胞狀態（簇5）（圖8e）。

圖8

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術應用企業，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！