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在類器官培養(yǎng)實驗中，很多研究者可能會遇到這樣的情況：干細胞過度自我更新，導(dǎo)致細胞類型單一而分化受限；又或者干細胞過度分化，增殖能力不足，難以維持類器官的長期培養(yǎng)。更為重要的是，器官在生物體內(nèi)也需要保持增殖與分化的平衡，如果不能很好的控制類器官的增殖與分化，也不能很好的模擬真正的器官。

那么，如何較好的平衡類器官的增殖與分化呢？

近期，一項發(fā)表在Nature Communications上的研究成果，為我們解決這個問題帶來了思路。該研究團隊開發(fā)出一種新型的腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在單一培養(yǎng)條件下實現(xiàn)干細胞快速生長和細胞多樣性的增加，盡可能地達到干細胞自我更新與分化之間的平衡。

該研究團隊的研究思路如下：

假設(shè)增強類器官的分化潛能就是增強類器官干細胞的的分化潛能，為了建立兼具細胞多樣性和高增殖能力的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，首先，利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LGR5-mNeonGreen報告系統(tǒng)，篩選出能顯著提高LGR5+干細胞比例的小分子組合，并驗證相應(yīng)培養(yǎng)條件下的細胞多樣性、和體內(nèi)器官的相似性，然后，在篩選出的最佳小分子組合培養(yǎng)條件下，通過施加抑制劑和其他小分子調(diào)節(jié)干細胞分化和增殖之間的平衡，最終，得到能夠兼顧高增殖能力和細胞多樣性的人類小腸類器官（hSIO）系統(tǒng)。

基于這樣的研究思路，科研人員通過建立“干性”增強的類器官系統(tǒng)、小分子功能分析確認以及信號通路分子調(diào)節(jié)等方法（可見附1），精確分析出調(diào)控哪些小分子和細胞因子的特定組合，可增強細胞多樣性分化，以及哪些信號分子組合，可增強細胞的特定分化，并對關(guān)鍵小分子的作用機制進行了初步探究。

可見平衡類器官的增殖與分化，并非一個簡單的實驗，需要從類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的分子層面去進行分析，才能最大程度地讓體外類器官模型向體內(nèi)器官靠近，得到理想的結(jié)果。

團隊研究方法概述

建立“干性”增強的類器官系統(tǒng)：利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LGR5- mneongreen報告系統(tǒng)來標記LGR5+干細胞，優(yōu)化小分子和生長因子的組合來模擬干細胞的體內(nèi)生態(tài)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)曲古霉素A（TSA或T，HDAC抑制劑）、2-磷酸- l -抗壞血酸（pVc或p，維生素C）和CP673451 （CP或C，PDGFR抑制劑）這3個小分子（TpC）的組合可以顯著增加LGR5陽性細胞（腸道內(nèi)干細胞）的比例。

在TpC條件下產(chǎn)生多樣化和可塑性的細胞類型：單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析揭示了TpC系統(tǒng)生成的類器官在組成和結(jié)構(gòu)方面與體內(nèi)器官具有高度的相似性，TpC系統(tǒng)支持在類器官中產(chǎn)生動態(tài)和可塑性的腸道細胞群，具有產(chǎn)生多譜系和經(jīng)歷細胞可塑性的潛力。

小分子在系統(tǒng)建立中發(fā)揮重要作用：通過流式細胞術(shù)、免疫熒光染色、RT-qPCR、scRNA-seq等分析細胞標記物的表達變化，確認各小分子的作用機制。TSA通過靶向HDACMBD-NuRD復(fù)合物增強LGR5干細胞維持；iBET-151能夠可逆地促進細胞增殖，抑制向分泌細胞分化。

施加特定的信號調(diào)節(jié)分子實現(xiàn)類器官譜系轉(zhuǎn)變：通過調(diào)節(jié)Wnt、Notch和BMP等信號通路，可逆地從分泌細胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)樵鰪娫鲋车哪c上皮細胞系，或單向分化為特定的腸道細胞類型。

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