在類器官培養實驗中，很多研究者可能會遇到這樣的情況：干細胞過度自我更新，導致細胞類型單一而分化受限；又或者干細胞過度分化，增殖能力不足，難以維持類器官的長期培養。更為重要的是，器官在生物體內也需要保持增殖與分化的平衡，如果不能很好的控制類器官的增殖與分化，也不能很好的模擬真正的器官。

那么，如何較好的平衡類器官的增殖與分化呢？

近期，一項發表在Nature Communications上的研究成果，為我們解決這個問題帶來了思路。該研究團隊開發出一種新型的腸類器官培養系統，該系統能夠在單一培養條件下實現干細胞快速生長和細胞多樣性的增加，盡可能地達到干細胞自我更新與分化之間的平衡。

該研究團隊的研究思路如下：

假設增強類器官的分化潛能就是增強類器官干細胞的的分化潛能，為了建立兼具細胞多樣性和高增殖能力的類器官培養系統，首先，利用CRISPR-Cas9技術構建LGR5-mNeonGreen報告系統，篩選出能顯著提高LGR5+干細胞比例的小分子組合，并驗證相應培養條件下的細胞多樣性、和體內器官的相似性，然后，在篩選出的最佳小分子組合培養條件下，通過施加抑制劑和其他小分子調節干細胞分化和增殖之間的平衡，最終，得到能夠兼顧高增殖能力和細胞多樣性的人類小腸類器官（hSIO）系統。

基于這樣的研究思路，科研人員通過建立“干性”增強的類器官系統、小分子功能分析確認以及信號通路分子調節等方法（可見附1），精確分析出調控哪些小分子和細胞因子的特定組合，可增強細胞多樣性分化，以及哪些信號分子組合，可增強細胞的特定分化，并對關鍵小分子的作用機制進行了初步探究。

可見平衡類器官的增殖與分化，并非一個簡單的實驗，需要從類器官培養系統的分子層面去進行分析，才能最大程度地讓體外類器官模型向體內器官靠近，得到理想的結果。

團隊研究方法概述

建立“干性”增強的類器官系統：利用CRISPR-Cas9技術構建LGR5- mneongreen報告系統來標記LGR5+干細胞，優化小分子和生長因子的組合來模擬干細胞的體內生態環境，發現曲古霉素A（TSA或T，HDAC抑制劑）、2-磷酸- l -抗壞血酸（pVc或p，維生素C）和CP673451 （CP或C，PDGFR抑制劑）這3個小分子（TpC）的組合可以顯著增加LGR5陽性細胞（腸道內干細胞）的比例。

在TpC條件下產生多樣化和可塑性的細胞類型：單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析揭示了TpC系統生成的類器官在組成和結構方面與體內器官具有高度的相似性，TpC系統支持在類器官中產生動態和可塑性的腸道細胞群，具有產生多譜系和經歷細胞可塑性的潛力。

小分子在系統建立中發揮重要作用：通過流式細胞術、免疫熒光染色、RT-qPCR、scRNA-seq等分析細胞標記物的表達變化，確認各小分子的作用機制。TSA通過靶向HDACMBD-NuRD復合物增強LGR5干細胞維持；iBET-151能夠可逆地促進細胞增殖，抑制向分泌細胞分化。

施加特定的信號調節分子實現類器官譜系轉變：通過調節Wnt、Notch和BMP等信號通路，可逆地從分泌細胞分化轉變為增強增殖的腸上皮細胞系，或單向分化為特定的腸道細胞類型。

Arcegen提供全套類器官培養試劑

基質膠

類器官培養基