cDNA是qPCR的模板，cDNA的質(zhì)量直接影響定量PCR（qPCR）的結(jié)果。提到cDNA，大家可能會用Nanodrop來測定其濃度和純度，這樣做真的是正確的嗎？cDNA質(zhì)量控制的關(guān)鍵又是什么呢？今天，我們就來了解下如何把控cDNA質(zhì)量。
cDNA要用Nanodrop測量濃度和純度？
用Nanodrop測量cDNA濃度和純度，這是常見的誤區(qū)之一。
首先，cDNA濃度難以準(zhǔn)確定量。逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物本身是一個混合體系，含有cDNA、未完全逆轉(zhuǎn)錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會干擾cDNA的吸光度，影響cDNA濃度的檢測結(jié)果。
其次，cDNA濃度并不影響qPCR實(shí)驗(yàn)最終Ct值。我們以小鼠肌肉組織RNA為模板，用不同試劑盒（dNTP 組分按1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度檢測）分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，起始RNA為500 ng。最后采用Nanodrop測定cDNA濃度，并取相同量cDNA分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：
不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的cDNA濃度相差較大，但定量實(shí)驗(yàn)Ct值幾乎一致。也就是說，逆轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少不會影響最終Ct值。
綜上，用Nanodrop測量cDNA濃度和純度是沒有必要的。
圖1. qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1，且最終Ct值與Nanodrop定量結(jié)果無線性關(guān)系
質(zhì)量把控關(guān)鍵：gDNA污染的識別與去除
gDNA的污染主要來源于RNA模板，只要保證RNA模板中沒有g(shù)DNA殘留，一般就不會造成gDNA污染。
那如何識別RNA模板中是否仍含有g(shù)DNA殘留呢？可以通過在逆轉(zhuǎn)錄之前將RNA模板進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來驗(yàn)證。
如下圖所示，泳道上部有明顯的雜帶，條帶拖尾嚴(yán)重模糊不清，則顯示可能有g(shù)DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。
圖2. 高質(zhì)量RNA（左）和RNA中有g(shù)DNA（右）
如果逆轉(zhuǎn)錄前沒有確認(rèn)模板中是否含有g(shù)DNA，可以在qPCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)立NRC陰性對照組（以未逆轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，不添加逆轉(zhuǎn)錄酶）驗(yàn)證，如無gDNA污染，NRC是不會擴(kuò)增的（Ct值＞35）；如果NRC擴(kuò)增（Ct＜35），而體系中無cDNA，則說明擴(kuò)增是由gDNA產(chǎn)生的，有污染。
那么發(fā)現(xiàn)了gDNA污染該如何去除呢？針對于此，目前主要的解決辦法是：在RNA提取時或逆轉(zhuǎn)錄前用DNA酶或gDNA清除劑去除。Arcegen CleanRNA脫氧核糖核酸酶I（2 U/uL）（N120005）可對提取后的RNA進(jìn)行處理，制備無dna RNA，從源頭解決困擾；快速一鏈cDNA合成反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132062）、一鏈cDNA合成反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132061）、快速gDNA消化與反轉(zhuǎn)一步法預(yù)混液（用于qPCR）（N132063），試劑盒中包含了gDNA消化液，可以在逆轉(zhuǎn)錄前去除gDNA，十分便捷。
產(chǎn)品推薦
| 產(chǎn)品應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
| 在RT-PCR和RT-qPCR反應(yīng)前制備無 dna RNA | N120005 | |
| 5min 完成 gDNA 消化與反轉(zhuǎn)，最少僅需 10PgRNA，兼容高 GC 樣本 |
Fast lst Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNAdigesterplus,forqPCR) |
N132062 |
| 經(jīng)典版 15min gDNA消化與反轉(zhuǎn)，高性價比 | N132061 | |
| 一步完成 gDNA 去除和反轉(zhuǎn)錄，消化&反轉(zhuǎn)僅需 5min，100 PgRNA 反轉(zhuǎn)錄結(jié)果也能保證 | N132063 |