單細(xì)胞懸液是生物醫(yī)學(xué)研究中重要的實(shí)驗(yàn)樣本，在單細(xì)胞懸液制備過程中，細(xì)胞凋亡和機(jī)械損傷釋放的基因組DNA，是形成黏稠團(tuán)塊、導(dǎo)致制備失敗的主要元兇。DNase I是一種能特異性切割DNA鏈的酶，在單細(xì)胞懸液制備中，它能夠高效降解細(xì)胞外的基因組DNA，從而降低溶液黏度。今天，我們就來學(xué)習(xí)下如何利用DNase I（脫氧核糖核酸酶）制備高質(zhì)量單細(xì)胞懸液。
第一步：樣本預(yù)處理
1. 對組織塊進(jìn)行機(jī)械破碎和酶學(xué)消化（如使用膠原酶、胰蛋白酶等），直至組織基本分散。
2. 將初步的細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)移至一個(gè)預(yù)冷的無菌離心管中。
3. 加入適量的預(yù)冷PBS（或特定的終止緩沖液）以稀釋和終止蛋白酶的消化反應(yīng)，防止過度消化。
4. 通過適當(dāng)孔徑的細(xì)胞篩（如70μm或40μm）過濾，去除未消化的大塊組織（此時(shí)的濾液有些黏稠）。
第二步：DNase I處理
1. 使用無菌的PBS稀釋DNase I原液至工作濃度。
2. 將準(zhǔn)備好的DNase I工作液直接加入過濾后的細(xì)胞懸液，輕柔地吹打混勻，確保酶與懸液充分接觸。
3. 溫和孵育：將離心管置于37℃水浴或培養(yǎng)箱中，孵育 5-15分鐘。可輕柔顛倒混勻一兩次。
第三步：反應(yīng)終止
1. 向離心管中加入足量的、含血清的完全培養(yǎng)基以終止反應(yīng)。
2. 在4℃條件下，以300-500 g的離心力離心5分鐘。
3. 緩慢地倒掉或吸出上清液，注意不要擾動(dòng)底部的細(xì)胞沉淀，去除DNase I以及被切割的DNA小片段。
4. 用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞沉淀，再次離心并棄去上清。重復(fù)此步驟一次，以確保徹底清除DNase I。
第四步：重懸與質(zhì)檢
1. 使用適量適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的緩沖液（如無血清培養(yǎng)基或PBS+0.04% BSA）輕柔地重懸細(xì)胞沉淀。
2. 使用臺(tái)盼藍(lán)排除法或其他活率檢測方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。此時(shí)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)良好的分散狀態(tài)，無明顯團(tuán)塊。
3. 用移液器吸取少量細(xì)胞懸液，懸液應(yīng)易于通過，無任何拉絲或黏稠感；調(diào)整細(xì)胞至目標(biāo)濃度，即可準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。
Tips
1. DNase I處理的最佳時(shí)機(jī)是在組織解離之后、任何精細(xì)操作（如細(xì)胞分選）之前。
2. 對于特別容易發(fā)生細(xì)胞死亡的組織（如腫瘤、腦組織），可能需要適當(dāng)增加DNase I的濃度或延長孵育時(shí)間。
3. DNase I只解決DNA引起的團(tuán)塊。如果團(tuán)塊是由細(xì)胞表面蛋白或細(xì)胞碎片引起，則需要考慮使用其他優(yōu)化解離方案。
通過以上步驟，就能收獲高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液啦！高質(zhì)量單細(xì)胞懸液制備除了標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，同樣需要高質(zhì)量DNase I，Arcegen精心為您準(zhǔn)備的CleanRNA脫氧核糖核酸酶 I (2 U/uL)，酶活高，消化能力強(qiáng)，從此單細(xì)胞懸液制備不再愁！
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| 消化單鏈和雙鏈 DNA，多用于制備單細(xì)胞懸液 | N120005 |