復(fù)孔的重現(xiàn)性往往事關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，“復(fù)孔平臺(tái)期信號(hào)高低不一，我的Ct值會(huì)不會(huì)受影響？”——幾乎每一個(gè)剛接觸qPCR的實(shí)驗(yàn)者都曾指著屏幕里分叉的終點(diǎn)熒光信號(hào)發(fā)出靈魂拷問。今天，本文將深入解答這一疑問：復(fù)孔平臺(tái)期信號(hào)差異究竟會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？
要想解決這個(gè)問題，先來(lái)了解下什么是平臺(tái)期。通常，在理想情況下，PCR擴(kuò)增應(yīng)遵循每循環(huán)DNA量翻倍的指數(shù)增長(zhǎng)規(guī)律。然而在實(shí)際反應(yīng)中，隨著循環(huán)數(shù)增加，反應(yīng)組分如Taq酶、dNTP和引物逐漸消耗，同時(shí)副產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致擴(kuò)增效率逐漸下降，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，可劃分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期三個(gè)階段。
一 基線期
通常為反應(yīng)開始后的前3至15個(gè)循環(huán)。此階段，擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，熒光信號(hào)強(qiáng)度尚未超過(guò)儀器背景水平，因此無(wú)法檢測(cè)到到有效的熒光信號(hào)變化。
二 指數(shù)增長(zhǎng)期
是擴(kuò)增效率最高的階段，接近理論上的指數(shù)增長(zhǎng)。該階段擴(kuò)增差異尚未顯著放大，復(fù)孔之間的熒光信號(hào)較為一致。通常將熒光閾值設(shè)定于該區(qū)間，當(dāng)熒光信號(hào)超過(guò)閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。此時(shí)，復(fù)孔間的Ct值重復(fù)性良好，一般要求△Ct小于0.5。
三 平臺(tái)期
出現(xiàn)在擴(kuò)增后期，此時(shí)反應(yīng)組分大量消耗，副產(chǎn)物抑制作用增強(qiáng)，擴(kuò)增速率顯著減緩。累積的微小差異被進(jìn)一步放大，不同復(fù)孔在平臺(tái)期的熒光信號(hào)可能出現(xiàn)較大差異，因此該階段的信號(hào)數(shù)據(jù)通常不用于定量比較。
圖1. 擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段
以下圖（圖2）為例，將293T-cDNA為模板，擴(kuò)增GAPDH基因，90個(gè)復(fù)孔。
圖2. 同一樣品的90個(gè)復(fù)孔擴(kuò)增曲線圖
由圖可見，該實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔重復(fù)性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)有效，但平臺(tái)期的熒光信號(hào)值均有差異。
因此，數(shù)據(jù)的有效性和復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)關(guān)系不大，主要與復(fù)孔間的△Ct有關(guān)，MIQE標(biāo)準(zhǔn)是△Ct＜0.5。
在復(fù)孔△Ct<0.5的情況下，復(fù)孔平臺(tái)期不同并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，那有沒有辦法可以讓復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)盡量一致呢？
1. 確保加樣的準(zhǔn)確性：1）qPCR各組分完全化凍后需要混勻；2）采用預(yù)混的方式進(jìn)行加樣，保證體系的均一性，可以將除模板以外的試劑進(jìn)行預(yù)混，分注至各管中；3）模板濃度高時(shí)，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。
2. 確保移液的精準(zhǔn)度：加樣過(guò)程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況，避免使用精準(zhǔn)度差的移液槍或者不配套的槍頭。
3. 體系混勻并進(jìn)行離心：體系加完后要用移液槍吹打并進(jìn)行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
4. qPCR試劑的選擇：選擇“預(yù)混液”形式的qPCR試劑，反應(yīng)體系只需加入引物和模板，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作步驟，減少了加樣誤差。
讀完本篇文章，相信你就不會(huì)再糾結(jié)復(fù)孔平臺(tái)期信號(hào)不同的問題了。
四 產(chǎn)品推薦
即使加樣1000管，也能保證體系的正確配置
—可示蹤qPCR染料法預(yù)混液2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (No/Low/High ROX)（Cat#N132134/N132135/N132136）
圖 Arcegen qPCR體系配置清晰示蹤圖
藍(lán)色：?jiǎn)卧噭w系；黃色：?jiǎn)文０弩w系；綠色：完全體系/上機(jī)體系
產(chǎn)品特點(diǎn)：
移液追蹤：即使手動(dòng)加樣1000管，也能保證體系的正確配置
擴(kuò)增優(yōu)異：在7個(gè)數(shù)量級(jí)線性范圍內(nèi)展現(xiàn)良好的線性
精準(zhǔn)度好：可精準(zhǔn)區(qū)分2倍濃度差異模板
重復(fù)性好：101數(shù)量級(jí)拷貝質(zhì)粒，20復(fù)孔偏差SD<0.2
穩(wěn)定可靠：反應(yīng)體系可于常溫放置24小時(shí)，產(chǎn)品反復(fù)凍融20次性能如常
相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
| 無(wú)需調(diào)節(jié)ROX，全平臺(tái)通用，快至 46min完成定量，96 復(fù)孔偏差 Ct<0.2，優(yōu)美曲線 |
2 x Universal qPCR Fluore Green MasterMix(No ROX adjustment) |
N132131 |
| 移液變色追蹤，防止加樣誤差，線性范圍跨7個(gè)數(shù)量級(jí)，高性價(jià)比，優(yōu)美曲線 | N132134 | |
| N132135 | ||
| N132136 | ||
| 兼容5重，靈敏度高達(dá)500copies/mL，可耐受0.5%體積全血 | N132141 | |
| miRNA加尾法定量，可區(qū)分同家族 miRNA 單堿基差異 | N132039 | |
| 兼容5重，靈敏度高達(dá)500copies/mL，快速程序30min 即出結(jié)果 | N132052 | |
| 無(wú)需調(diào)節(jié) ROX，RNA 檢測(cè)靈敏度高達(dá) 0.1Pg，DNA靈敏度高達(dá)單拷貝，可精準(zhǔn)分辨2倍濃度差異模板 | N132051 |