復孔的重現性往往事關實驗結果的可信度，“復孔平臺期信號高低不一，我的Ct值會不會受影響？”——幾乎每一個剛接觸qPCR的實驗者都曾指著屏幕里分叉的終點熒光信號發出靈魂拷問。今天，本文將深入解答這一疑問：復孔平臺期信號差異究竟會不會影響實驗結果？

要想解決這個問題，先來了解下什么是平臺期。通常，在理想情況下，PCR擴增應遵循每循環DNA量翻倍的指數增長規律。然而在實際反應中，隨著循環數增加，反應組分如Taq酶、dNTP和引物逐漸消耗，同時副產物不斷積累，導致擴增效率逐漸下降，擴增曲線呈現典型的“S”型，可劃分為基線期、指數增長期和平臺期三個階段。

一 基線期

通常為反應開始后的前3至15個循環。此階段，擴增產物量較少，熒光信號強度尚未超過儀器背景水平，因此無法檢測到到有效的熒光信號變化。

二 指數增長期

是擴增效率最高的階段，接近理論上的指數增長。該階段擴增差異尚未顯著放大，復孔之間的熒光信號較為一致。通常將熒光閾值設定于該區間，當熒光信號超過閾值時對應的循環數即為Ct值。此時，復孔間的Ct值重復性良好，一般要求△Ct小于0.5。

三 平臺期

出現在擴增后期，此時反應組分大量消耗，副產物抑制作用增強，擴增速率顯著減緩。累積的微小差異被進一步放大，不同復孔在平臺期的熒光信號可能出現較大差異，因此該階段的信號數據通常不用于定量比較。

圖1. 擴增曲線的三個階段

以下圖（圖2）為例，將293T-cDNA為模板，擴增GAPDH基因，90個復孔。

圖2. 同一樣品的90個復孔擴增曲線圖

由圖可見，該實驗的復孔重復性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標準，數據有效，但平臺期的熒光信號值均有差異。

因此，數據的有效性和復孔平臺期熒光信號關系不大，主要與復孔間的△Ct有關，MIQE標準是△Ct＜0.5。

在復孔△Ct<0.5的情況下，復孔平臺期不同并不影響實驗結果，那有沒有辦法可以讓復孔平臺期熒光信號盡量一致呢？

1. 確保加樣的準確性：1）qPCR各組分完全化凍后需要混勻；2）采用預混的方式進行加樣，保證體系的均一性，可以將除模板以外的試劑進行預混，分注至各管中；3）模板濃度高時，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。

2. 確保移液的精準度：加樣過程需確保移液槍未出現漏氣、漏液的情況，避免使用精準度差的移液槍或者不配套的槍頭。

3. 體系混勻并進行離心：體系加完后要用移液槍吹打并進行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實驗結果不準確。

4. qPCR試劑的選擇：選擇“預混液”形式的qPCR試劑，反應體系只需加入引物和模板，大大簡化實驗的操作步驟，減少了加樣誤差。

讀完本篇文章，相信你就不會再糾結復孔平臺期信號不同的問題了。

四 產品推薦

即使加樣1000管，也能保證體系的正確配置

—可示蹤qPCR染料法預混液2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (No/Low/High ROX)（Cat#N132134/N132135/N132136）

圖 Arcegen qPCR體系配置清晰示蹤圖

藍色：單試劑體系；黃色：單模板體系；綠色：完全體系/上機體系

產品特點：

移液追蹤：即使手動加樣1000管，也能保證體系的正確配置

擴增優異：在7個數量級線性范圍內展現良好的線性

精準度好：可精準區分2倍濃度差異模板

重復性好：10¹數量級拷貝質粒，20復孔偏差SD<0.2

穩定可靠：反應體系可于常溫放置24小時，產品反復凍融20次性能如常

相關產品