是干貨??！神經研究中啟動子和血清型這樣選！

神經系統分為中樞神經系統（Central nervous system, CNS）和外周神經系統（Peripheral nervous system，PNS）。中樞神經系統包括腦和脊髓，分別位于顱腔和椎管內，是神經系統的主要部分，外周神經系統包括與腦相連的腦神經（cranial?nerves）和與脊髓相連的脊神經（spinal?nerves）。隨著研究的深入，人們對神經系統功能已經有了更近一步的認識，但由于神經系統的復雜性、組織再生能力的有限性以及血腦屏障對藥物傳送的阻隔，使用傳統藥物和外科手術方法治療神經系統類疾病仍困難重重。

目前，基因療法已被應用于多種疾病的治療，利用病毒載體將遺傳物質傳遞到器官周圍，并在靶細胞中實現特異表達，進而實現基因治療。在神經科學研究中，尤其是在體實驗，通常利用腺相關病毒工具載體研究基因的功能作用，那么如何才能更高效地利用AAV在神經系統進行基因轉導呢？今天我們就一起學習AAV在神經研究中的選擇策略。

據報道，目前適用于神經系統的AAV血清型有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等十幾種，不同的血清型在神經系統不同部位的感染效率及擴散能力不同，合適的血清型關乎基因是否能夠實現高效穩定表達，甚至關乎最終的研究結果，因此綜合標記的細胞和每種AAV血清型的特性等因素來選擇合適的AAV血清型至關重要。根據文獻報道，AAV1,2和5在CNS轉導水平有限，且表現出不同的細胞特異性，如AAV1和5能轉導神經元和膠質細胞，而AAV2只能轉導神經元。AAV9在CNS中的應用則較為廣泛，具有強的擴散性，且能穿過血腦屏障（BBB）實現基因高表達。而在外周神經系統中，AAV9、rh10、PHP.S的感染效果較好。

常見的AAV病毒載體都是順向標記，極少能進行逆行傳遞，這大大限制了AAV載體在神經環路示蹤中的應用。直到2016年，研究人員在AAV2的基礎上，通過定向進化的方式改造出一種具有逆向示蹤功能的AAV2突變體——AAV2-retro，該載體能夠在小鼠大腦中進行有效的神經環路逆向標記，且其逆行示蹤能力和效率與傳統的逆行示蹤劑相當。圖2所示為rAAV2-retro的開發過程及應用實例：

2017年張礪教授團隊研究報道AAV1能在高滴度條件下呈順向跨突觸傳播，與Cre依賴的報告系統相結合，可高效和特異性地驅動Cre依賴的外源基因在突觸后神經元中的表達，以標記突觸后神經元。2020年該研究團隊再次深入研究了AAV1順向跨突觸標記的作用機制——依賴于突觸囊泡的釋放，同時揭示了其在多種神經環路中的廣泛應用，為AAV1作為順向跨突觸示蹤病毒工具對神經元及其投射腦區進行標記提供了諸多證據，如圖3所示。

此外，張礪教授團隊還證實scAAV1-hSyn-Cre相比AAV1載體具有更優越的順向跨突觸標記能力，可在興奮性、抑制性、神經調質和腦-脊髓等多種神經環路中有效、特異地標記單突觸靶神經元及其輸出，從而解析不同的功能/行為。

血腦屏障的存在對中樞神經系統有很強的保護作用，但同時它也能阻隔藥物的傳遞和吸收，使神經系統疾病的治療變得異常困難，研究人員通過進一步改造AAV衣殼，發現AAV9& AAVPHP.B&AAVPHP.eB&AAVPHP.S可以有效介導基因由外周向中樞神經系統的跨越，繼而將遺傳物質遞送至大腦或脊髓中。研究結果顯示，AAV-PHP.B可以有效地轉導成年小鼠大腦和脊髓的神經元，AAV-PHP.eB降低了誘導大多數中樞神經系統神經元所需的病毒載量，而AAV-PHP.S顯示出對周圍神經元的更好趨向性?？傊?，這些AAV變體可以有效介導基因由外周向中樞神經系統的跨越，更好地應用于神經環路研究。

美國哈佛大學聯合武漢大學人民醫院研究團隊利用合理性設計的方法，將選定的細胞穿透肽 CPP（一 組可以穿過細胞膜或組織屏障的短肽）分別插入 AAV9 衣殼（Q588 和 A589 之間）生成突變體庫， 將包裝好的 AAV 突變體通過靜脈注射至小鼠體內，經過序列優化和篩選測試，得到血腦屏障穿透性顯著優于 AAV9 的 AAV.CPP.16。通過在不同品系小鼠和食蟹猴動物模型中進行驗證，發現靜脈注射AAV.CPP.16 可以高效跨越血腦屏障，感染 CNS 神經元細胞、星形膠質細胞以及脊髓運動神經元?；谛∈笈c食蟹猴研究結果發現，系統給藥 AAV.CPP.16 仍可感染肝臟、肌肉、心臟等外周臟器，但在檢查的組織中均未觀察到明顯的病理反應，也未引起背根神經節退化變性。重要的是，研究人員發現AAV.CPP.16 可用于 GBM 小鼠模型的基因治療，并具有持久高效的抗腫瘤作用。

星形膠質細胞是中樞神經系統損傷的關鍵反應細胞，在脊髓損傷的發病機制中發揮著重要作用。星形膠質細胞功能障礙已被證實是腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病等神經退行性疾病的核心特征。中科院徐富強團隊對一系列工具病毒進行改造和篩選，開發了一種新的高效逆行靶向投射神經元的重組腺相關病毒 rAAV11。研究發現，rAAV11 可以高效逆行靶向投射神經元，且不表現出順行跨突觸特征；rAAV11 還具備優秀的逆行標記效率，能示蹤 rAAV2 難以轉導的投射神經元。值得注意的是，rAAV11 可以高效且特異性靶向星形膠質細胞，為星形膠質細胞的研究提供了更加有力的病毒工具。

北京生命科學研究所羅敏敏實驗室通過定向進化策略，開發了一系列能夠在體內和體外高效侵染小膠質細胞的新型 rAAV 載體。該研究針對 AAV9 的衣殼蛋白進行改造，鑒定篩選出兩個衣殼蛋白（AAV-cMG. WPP 和 AAV-cMG.QRP）能夠在一定程度上提高 rAAV 病毒對體外培養的小鼠小膠質細胞的侵染效率。以此為基礎，研究團隊針對 AAV-cMG.QRP 的插入肽段及其在衣殼蛋白插入位點的相鄰氨基酸進行突變篩選，成功得到了高效侵染體外培養小膠質細胞的 AAV-cMG 衣殼蛋白，同時并不導致小膠質細胞的激活。

研究人員進一步在 AAV-cMG.WPP 基礎之上構建新的 AAV 突變文庫，并在小膠質細胞特異的 Cx3cr1-CreER 轉基因小鼠腦內進行針對性體內篩選，成功鑒定得到 AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，能夠在體內高效侵染小膠質細胞，且不誘導小膠質細胞免疫激活。