編者按
準確預測腫瘤擴散風險和治療效果對于個性化治療而言至關重要。目前，確定腫瘤侵襲性和擴散性的診斷原則依賴于腫瘤-淋巴結-轉移（TNM）分期原則。然而，N或M參數，需要直徑為一厘米或更大的病灶，通過醫學成像或活檢檢查來確定。這些評估存在診斷敏感性和特異性較差的問題，因此迫切需要更多的預測方法來評估腫瘤侵襲和擴散。
今天，我們分享2022年2月由瑞典林雪平大學研究團隊發表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=11.4）的一項研究成果，該研究開發了將NSCLC PDX材料植入斑馬魚幼魚的新型穩健方法，表現出優異的植入率并準確地再現了相應小鼠PDX模型和患者本身對紫杉醇和厄洛替尼的反應，可以直接從患者活檢中建立ZTX模型，而無需事先在小鼠中進行擴展。基于PDX模型植入的ZTX分析能夠準確地概括非小細胞肺癌的藥物反應和侵襲表型。
文章題目
Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer
雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.4）
發表時間：2022年2月9日
作者：Zaheer Ali, Malin Vildevall等
單位：瑞典林雪平大學（Linköping University）等
01、研究背景
準確預測腫瘤擴散風險和治療效果對于個性化治療而言至關重要。目前，確定腫瘤侵襲性和擴散性的診斷原則依賴于腫瘤-淋巴結-轉移（TNM）分期原則。然而，N或M參數，需要直徑為一厘米或更大的病灶，通過醫學成像或活檢檢查來確定。這些評估存在診斷敏感性和特異性較差的問題，因此迫切需要更多的預測方法來評估腫瘤侵襲和擴散。
目前，預測腫瘤治療結果的黃金標準是使用在免疫功能低下的小鼠中生成的患者來源的異種移植（PDX）模型。該模型能更準確的預測患者的反應，且具有高度特征。因此，PDX模型已成為臨床前研究非常有價值的資源。然而，PDX模型無法準確評估局部和全身轉移。因此需要采用其他方法來獲取有關腫瘤擴散和藥物抗轉移療效的信息，并將與現有PDX模型相關的其他數據結合起來。
近來，斑馬魚腫瘤異種移植（ZTX）系統已成為腫瘤學和腫瘤生物學研究中一種強大的補充體內系統。通過植入腫瘤細胞系（有時與非惡性腫瘤浸潤細胞結合來模擬腫瘤微環境）生成ZTX模型。然而，由于已建立的細胞系可能會隨著時間的推移而發生表型漂移，因此這些模型主要用于基礎研究或早期臨床前藥物開發。為了更好地再現患者特異性癌癥，ZTX模型是通過直接植入未擴增的患者腫瘤樣本而生成的，并被證明可以準確地概括相應患者對兩種藥物治療的藥物反應概況。
然而，用于此類測試的腫瘤活檢是新獲得的，因此尚未達到已建立的細胞系或PDX模型的特征。此外，腫瘤活檢組織很小，并且在ZTX模型中不會擴大，因此只能用于一項或幾項研究，之后患者樣本就會被消耗掉。利用冷凍保存的PDX模型作為ZTX平臺的起始材料可能會克服這些問題，但目前缺乏將PDX和ZTX相結合的方法。此外，目前尚不清楚由此產生的ZTX模型將在多大程度上保留癌癥患者的重要病理生理學特征。
肺癌是所有癌癥類型中死亡率最高的。其高死亡率很大程度上是由于當前醫療治療的效率低下，很少能使患者獲得長期緩解，再加上缺乏準確判斷全身傳播風險的診斷技術。因此，為非小細胞肺癌患者開發新的藥物和診斷技術尤為重要。這導致了大量非小細胞肺癌（NSCLC）PDX模型的產生，這些模型反過來又被大量使用和表征。
研究人員開發了將NSCLC PDX材料植入斑馬魚幼魚的新型穩健方法，表現出優異的植入率并準確地再現了相應小鼠PDX模型和患者本身對紫杉醇和厄洛替尼的反應。可以直接從患者活檢中建立ZTX模型，而無需事先在小鼠中進行擴展。基于PDX模型植入的ZTX分析能夠準確地概括非小細胞肺癌的藥物反應和侵襲表型。
02、研究成果
1. 將冷凍保存的小鼠PDX模型的PDX組織植入斑馬魚幼魚
為了建立生成斑馬魚腫瘤異種移植（ZTX）模型的方法，研究人員共獲得了39個非小細胞肺癌模型。將冷凍保存的組織碎片消化，并與來自相同模型的冷凍保存的細胞懸浮液進行對比。分別消化或解凍后，用熒光染料DiI標記細胞，測定其活力，最后將標記的細胞皮下植入2 dpf斑馬魚幼魚的卵周間隙（圖1A）。在植入后和3天后分別拍攝圖像，并確定腫瘤大小的相對變化（圖1B和C）。研究人員發現，與先消化組織，冷凍保存為細胞懸浮液然后解凍相比，來自冷凍保存的組織碎片的細胞在解凍后分解，產生的腫瘤存活率更高（圖1C）。與細胞懸浮液組相比，組織碎片組中的腫瘤相對于植入時平均增大了2.2倍。因此，研究人員決定在以后的所有實驗中使用解凍后分解的冷凍保存的組織碎片。
接下來，對斑馬魚幼魚的植入效率進行評估。在30個模型中，有25個模型植入成功（n >20）。植入的25個模型在3 dpi時產生的腫瘤平均為植入時大小的64%（圖1D），這表明在3天的生長期內，腫瘤細胞死亡在很大程度上被腫瘤增殖所平衡。有趣的是，對于大多數測試模型而言，3 dpi時的相對腫瘤大小與植入前的細胞活力無關，但產生高度增殖腫瘤的三個模型的相對腫瘤大?。ㄏ鄬Υ笮?ge;100%）確實表現出在植入前具有較高細胞活力的模型中更強勁生長的趨勢（圖1E）。同樣，相對腫瘤大小也與可從樣品中提取的細胞數量無關（圖1F）。
為了確定ZTX平臺的穩健性，由不同的研究人員使用單獨的冷凍保存組織碎片重新運行11個模型，并在不同的日子解凍和處理。發現第一次和第二次運行之間ZTX腫瘤的發育總體上沒有差異（圖1G），這表明ZTX平臺是穩定的。
研究人員還評估了所有30個模型中小鼠腫瘤發生和生長的兩個重要參數，即腫瘤倍增時間和生長速度，并將其與相應ZTX模型的生長情況進行了比較。結果表明，與ZTX模型類似，小鼠PDX模型表現出不同的生長和攝取率（圖1H和I），但與相應ZTX腫瘤的相對生長相關性較差。這是由于一些腫瘤具有高基質含量，并且與腫瘤細胞相比，非惡性基質細胞的增殖能力較低，因此在植入后的幾天內對腫瘤生長的貢獻較小。同樣，雖然模型中的基質含量在4%到30%之間變化，但這與3 dpi時ZTX腫瘤的相對大小無關（圖1J）。
圖1
2. 使用ZTX模型可準確重現對標準治療藥物的治療反應
研究人員對ZTX平臺中25個模型的初始隊列的藥物敏感性和耐藥性概況進行研究，并將其與小鼠PDX模型的相應概況進行比較。在腫瘤植入后將斑馬魚培養在紫杉醇和厄洛替尼溶液中3天（圖2A）。紫杉醇和厄洛替尼的臨床相關劑量分別為20 mg/kg和10 mg/kg，正常斑馬魚在紫杉醇和厄洛替尼在該濃度下均具有耐受性（圖2B、C）。
接下來，用厄洛替尼或紫杉醇處理25個模型中每個模型的20尾腫瘤幼魚，并評估每組在0 dpi與3 dpi時的相對腫瘤大小。將藥物治療組中腫瘤的相對大小與對照組中腫瘤的相對大小進行標準化，得出了模型的相對藥物誘導回歸的測量值（圖2D和E）。厄洛替尼和紫杉醇分別在25個模型中的14個和20個中有效地引起原發性腫瘤消退（圖2D和E）。
這些結果反映了與厄洛替尼相比紫杉醇的作用機制更廣泛，同時也證明了不同PDX模型對標準治療的個體反應存在高度差異。隨機選擇15個模型，并分別確定了其小鼠對厄洛替尼和紫杉醇的藥物反應特征。結果表明，厄洛替尼和紫杉醇抑制小鼠腫瘤生長的效力不同，從完全抑制到73.7%抑制（圖2F和G）。
重要的是，這些藥物在ZTX模型中的功效與其在小鼠PDX模型中的腫瘤生長抑制功效密切相關（圖2F和G）。總體而言，ZTX平臺能準確再現對非小細胞肺癌PDX模型對標準治療的反應。
圖2
3. 紫杉醇或厄洛替尼的療效可能是由表觀遺傳學而非基因決定
接下來，為了研究某些基因突變或基因表達水平的變化是否可以預測對厄洛替尼或紫杉醇的反應與耐藥性，研究人員分析了與癌癥生物學和病理學相關的37個常見基因的突變譜和表達水平（圖3A-C）。發現大多數模型中分析的大多數基因都是野生型，但tp53除外，它在27個模型中有21個發生突變。然而，由于覆蓋率較低，某些基因僅進行了部分分析，因此在某些模型中的突變狀態尚未確定。將與27個模型的基因突變譜與藥物反應譜進行比較，發現無論是厄洛替尼還是紫杉醇，都沒有明確的基因突變模式賦予其敏感性或耐藥性（圖3A）。
研究人員通過RNA測序進一步檢查了該組中另外36個基因的表達水平（圖3B和C）以比較敏感模型和耐藥模型中的表達，發現P53抑制因子Mdm2、音Patched1和mTOR抑制劑TSC1的過度表達與厄洛替尼耐藥相關（圖3B）。類似地，Patched1和NRAS的過表達與紫杉醇耐藥性相關，而ERBB2和FOX-A的過表達與紫杉醇反應顯著相關（圖3C）。
這些結果表明，Patched1的高表達可能會導致肺癌患者對一線治療產生耐藥性，這一假設應在未來的臨床研究中進一步研究。
圖3
4. 藥物誘導的腫瘤擴散抑制與腫瘤療效無關
ZTX模型的主要優點之一是可以評估早期腫瘤侵襲和擴散。為了研究ZTX平臺是否也可以使用PDX模型確定患者腫瘤的侵襲性和擴散性，研究人員將最初的25個可植入PDX模型中生成的細胞植入斑馬魚幼魚。在3 dpi時評估尾部造血叢主要轉移灶中出現的標記腫瘤細胞數量（圖4A-C）。
結果表明，這些模型在ZTX系統中表現出高度異質性的轉移能力（圖4C）。雖然模型的EMT評分和基質含量與斑馬魚中接種的轉移細胞數量無關（圖3D和E），但PDX模型在植入斑馬魚幼魚之前的較高血管化程度明顯與轉移細胞的增加接種有關（圖4F），這表明與EMT評分或基質含量相比，模型的血管生成特性與其轉移擴散更密切相關。
接下來，研究人員通過評估每種植入模型治療后的轉移反應來評估厄洛替尼和紫杉醇的抗轉移功效。雖然這些治療在某些模型中抑制了轉移擴散（圖4B和G），但在測試的26個模型中的大多數模型中，它們在這方面無效。
為了評估抗轉移功效是否與藥物在ZTX平臺中引起原發性腫瘤消退的能力相關，繪制了載體組中腫瘤大小的變化與轉移細胞數量的關系（圖4H）以及厄洛替尼或紫杉醇治療模型的抗腫瘤功效與抗播散功效的對比（圖4I和J）。結果表明，腫瘤生長和轉移率之間不存在相關性（圖4H）。
然而，令人驚訝的是，對于兩種測試藥物中的任何一種，藥物誘導的腫瘤消退的效力與藥物誘導的腫瘤擴散抑制的效力并沒有密切相關（圖4I和J），盡管這種相關性的趨勢可能會增加。從厄洛替尼治療的模型中可以看出（圖4I）。這表明EGFR阻斷可能在更大程度上抑制敏感模型中的腫瘤生長和擴散，而在紫杉醇治療的模型中對腫瘤生長和擴散的影響似乎彼此不相關。
圖4
5. ZTX模型中的腫瘤擴散可高度預測患者體內的腫瘤擴散情況
接下來研究了ZTX模型在多大程度上重現了該模型所源自的患者的侵襲性腫瘤表型。在初始研究中使用的30個模型中，12個來自LN-的患者，16個來自LN+的患者。其余兩名患者缺乏此類信息（圖5A）。
在植入斑馬魚幼魚的25個模型中，15個來自LN+患者，9個來自LN-患者，其中一個來自淋巴結狀態未知的患者。有趣的是，與源自LN-患者的模型相比，源自LN+患者的PDX模型在ZTX平臺中移植的轉移細胞平均多出2.1倍（圖5B和C）。在ZTX平臺中接種5個或更多轉移細胞的七個模型均源自LN+患者，這意味著在此臨界值下可以以100%的靈敏度積極預測淋巴結轉移（圖5C和D）。
此外，在接種少于5個轉移細胞的17個模型中，有9個來自LN-患者，導致在此臨界值下的診斷特異性為53%。為了進行比較，最佳臨床標準，即腫瘤（T）分期，與該患者隊列中的淋巴結轉移無關（圖5E）。其他但在所有病例中較弱的淋巴結受累指標包括與腺癌或鱗狀細胞癌相比被診斷為大細胞癌的患者（圖5F）以及具有中度或低分化腫瘤的患者（圖5G），診斷時年齡較?。▓D5H）且為女性（圖5I）。
然而，與LN-患者相比，小鼠PDX模型的侵襲特征，包括基質含量、血管分布和EMT評分，在LN+患者中沒有顯著差異（圖5J和L）。綜合起來，這些發現強烈表明，由冷凍保存的PDX材料生成的ZTX模型能夠密切再現患者腫瘤的侵襲性表型，并以比當前臨床金標準更高的靈敏度預測淋巴結轉移。
圖5
6. ZTX模型的藥物反應可高度預測患者的藥物反應
為了進一步驗證30個PDX模型的初始隊列中的研究結果，并進一步比較ZTX模型中的治療結果與在患者中觀察到的結果，研究人員獲得了9個PDX模型（圖6A-C），其中患者的治療結果是已知的，這些模型對厄洛替尼和紫杉醇表現出不同的反應。
五個模型源自厄洛替尼治療后復發的患者，另外三個模型來自紫杉醇治療后復發的患者（均未獲得緩解）。這八個模型對ZTX平臺中的厄洛替尼和紫杉醇具有類似的耐藥性，從而證明ZTX與患者治療結果之間具有100%的相關性（圖6A和B）。只有一個來自局部癌癥患者，該模型在ZTX模型中表現出低于臨界值的擴散。在源自患有已知轉移性疾病的患者的四種模型中，三種表現出高于臨界值的擴散，而一種則沒有（圖6C）。因此，在PDX模型的驗證中，ZTX系統中的正確預測患者的轉移性的準確度為80%。
圖6
7. ZTX模型可以直接從NSCLC患者活檢中建立
接下來，為了確定是否可以將新鮮收集的非擴展NSCLC患者活檢組織植入斑馬魚胚胎中，研究人員開展了一項臨床概念驗證研究，招募了四名患者。其中三名患者被診斷患有腺癌，而一名患者被診斷患有鱗狀細胞癌（圖6D）。所有四名患者樣本均植入斑馬魚胚胎中，盡管植入后3天時腫瘤的相對大小略低于使用PDX模型時的大?。▓D6E）。
所有ZTX模型均表現出高于臨界值的擴散，這表明患者可能患有淋巴結陽性或轉移性疾病。不幸的是，所有四種ZTX模型也對厄洛替尼和紫杉醇均具有耐藥性，這表明患者可能無法從這些治療中獲得治療益處。雖然需要進行更大規模的前瞻性研究來確定基于直接使用腫瘤活檢建立 ZTX模型來預測NSCLC患者治療結果和淋巴結轉移的準確性，但這項概念驗證研究證明了這種方法的可行性方法。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！