編者按：膽管上皮細胞在缺血再灌注時極易受到損傷，因此肝移植過程中缺血性膽管病是治療失敗的主要原因之一[1-3]。目前，膽管上皮對缺血和再灌注的反應被廣泛認為是動態的和階段性的，但由于缺乏合適的細胞或動物模型，膽管缺血損傷的分子機制很大程度上仍未被探索。
肝源性膽管細胞是人類膽管上皮細胞的一種，它們能夠自我組裝并在體外保留大多數膽管特征[4-6]。在本研究中，研究人員利用人源肝內膽管類器官（ICOs）進行缺氧/復氧刺激模擬缺血性膽管損傷，觀察到膽管細胞增殖的動態變化、上皮-間充質轉化（EMT）相關標志物上調等，與患者組織結果相似。在缺血和復氧時細胞呈現出不同階段的死亡模式，而caspase抑制劑不能緩解缺血性膽管損傷，反而進一步促進了細胞壞死。此外，臨床級α-1 antitrypsin（ATA1）被發現能抑制膽管細胞的凋亡從而發揮膽管保護作用。本研究為膽管疾病的機制研究及藥物篩選提供了強有力的工具。
一、主要研究結果
1. 對轉染HIF-1α報告基因的ICOs進行不同缺氧時間的處理，72h后細胞中的HIF-1α大量表達，呈現缺氧反應。此時，類器官體積顯著減小，有發黑現象。接著復氧6h，ICOs中肌動蛋白細胞骨架明顯解體，細胞核大量碎裂，顯示凋亡樣表型。
2. 延長復氧時間至24h，ICOs細胞活力較缺氧時明顯增加，表達增殖標記物Ki67的細胞比例增加。這些結果與之前的研究一致，提示缺血抑制膽道增殖，再灌注后可在一定程度上恢復其增殖能力。
3. 利用轉錄組學測序分析缺氧及復氧條件下ICOs中基因變化情況，結果顯示膽管細胞相關基因（MMP7、LGALS2、SOX9、GGT6、PPFIBP2、CFTR等）和上皮細胞表達基因（ANXA4、CD24、HNF1B等）整體下調；在缺氧的ICOs中，與EMT相關的基因（ITGB3、LOXL2、VIM、TGFB1和PLOD2）明顯上調。免疫染色進一步證實缺氧處理后ICOs中TGF-β和N-cadherin的表達增加，與患者組織切片染色結果一致。這些數據表明在缺氧/復氧應激刺激和肝移植會促進ICOs中EMT相關標志物的上調。
4. 鑒于缺血再灌注時可引起肝臟不同程序的細胞死亡，研究人員對ICOs刺激后凋亡和壞死相關基因的轉錄譜進一步分析，結果顯示內源性凋亡基因在缺氧和復氧條件下均上調；復氧后外源性凋亡相關基因（如TRAF2、CASP8和TNFRSF10A）明顯上調；同時，復氧時壞死相關基因（如MLKL, PGAM5和DNM1L）也出現了上調。凋亡及壞死相關標志物（active caspase 3、cleaved caspase 8和pMLKL）的免疫熒光染色也驗證了上述結果。這些發現表明在缺血再灌注模擬條件下生長的ICOs在特定階段會誘導凋亡和壞死。
5. 使用ICOs在缺氧/復氧刺激造模條件評價化合物的藥效，結果顯示口服caspase抑制劑Emricasan無論是缺氧或復氧條件下都未能挽救ICOs，類器官持續發黑，細胞核固縮。Emricasan抑制了缺氧條件下ICOs caspase 3的活性，但表達pMLKL+的細胞顯著增多，提示其引起了壞死性凋亡。而絲氨酸蛋白酶抑制劑ATA1恢復了缺氧和復氧過程中ICOs的上皮結構，抑制了缺氧誘導的ICOs中caspase 3的激活和MLKL的磷酸化，表明A1AT對缺氧/復氧誘導的損傷發揮了保護作用。
二、結語
作為斑馬魚生物技術應用企業，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展科研及研發服務、智慧實驗室建設和精準醫療三大業務。目前，我們已研發出成熟的膽管類器官培養基，歡迎前來咨詢！
參考資料：
[1] [Chan EY, Olson LC, Kisthard JA, et al. Ischemic cholangiopathy following liver transplantation from donation after cardiac death donors. Liver Transpl. 2008; 14: 604–610.
[2] Nakanuma Y. Tutorial review for understanding of cholangiopathy. Int J Hepatol. 2012; 2012: 1–9.
[3] Deltenre P, Valla D-C. Ischemic cholangiopathy. Semin Liver Dis. 2008; 28: 235–246
[4] Shi S, Verstegen MMA, Roest HP, et al. Recapitulating cholangiopathy-associated necroptotic cell death in vitro using human cholangiocyte organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2022; 13: 541–564.
[5] Verstegen MMA, Roos FJM, Burka K, et al. Human extrahepatic and intrahepatic cholangiocyte organoids show region-specific differentiation potential and model cystic fibrosis-related bile duct disease. Sci Rep. 2020; 10: 21900
[6] Huch M, Gehart H, van Boxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015; 160: 299–312.