重組腺相關病毒(rAAV)作為一種靶向性高和安全性好的病毒載體，被廣泛用于基因的傳遞和表達，也被認定為未來非常有前景的基因治療載體。早在上世紀90年代科學家就選擇肺作為靶向實驗器官，利用rAAV進行肺部疾病的臨床研究。眾所周知，rAAV的轉導效率與AAV血清型及給藥途徑等因素息息相關，今天小V就帶大家一起學習一下在肺部應用中有關AAV血清型、啟動子及給藥途徑的選擇策略。
研究表明，針對肺部感染rAAV在血清型上的選擇根據動物模型的不同而存在差異，主要體現在小鼠及較低等靈長類動物與高等靈長類動物之間。在小鼠及一些較低等的靈長類動物中，AAV5及AAV6是感染肺部的理想選擇；針對高等靈長類動物，AAV1對肺部的感染效率更高；在肺癌的研究中，我們通常推薦AAV2血清型。
小鼠與低等靈長類動物肺部 AAV5/AAV6 AAV1 AAV2
種類
AAV血清型推薦
高等靈長類動物肺部
肺癌
二、啟動子的選擇
根據不同的注射方式和實驗目的，可選擇不同的啟動子以提高AAV在肺部的表達效率。如下圖所示，CMV在啟動真核基因表達方面具有極高的效率，可高效感染小鼠肺部；CAG同樣具有出色的感染氣道的能力。此外，如果要感染肺臟中特定類型的細胞，還可以考慮選擇細胞特異性的啟動子，如內皮細胞啟動子ICAM2或者平滑肌細胞啟動子SM22α，可實現對內皮細胞或平滑肌細胞的特異性感染。
三、常用的肺部注射方式
AAV感染肺部的方法有多種，較為常用的方法有鼻內滴注法、氣管插管術、氣管內注射，如果對肺部感染AAV的特異性要求較低，也可采用靜脈注射、腹腔注射等方法，當進行肺癌成瘤實驗時，也可采用瘤內注射的方式。下面對AAV感染肺部常用的三種方法進行介紹。
1、鼻內滴注法
鼻內滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡單且對設備要求低，對新手實驗員也同樣適用。缺點是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實現。
操作步驟
①腹腔注射***和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：為了保持小鼠穩定的呼吸頻率，不應過度麻醉。
②甲按上圖所示兩種方法將小鼠控制好，防止其用嘴呼吸；
③乙緩慢滴一滴AAV懸液于小鼠鼻孔內壁，待液體被吸入后再滴下一滴，重復此操作至40μL AAV懸液全部滴完；
④使小鼠保持上述姿勢約30~60s，以便AAV懸液充分進入下呼吸道；
⑤待小鼠在籠中恢復10min后，重復上述操作，再次給藥40μL（每只小鼠共給藥80μL）；
⑥將小鼠放回籠中直至完全清醒。
2、氣管插管術
口腔氣管插管術能夠將病毒載體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術的風險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達肺內，所以要嚴格控制AAV的使用量。同時，與鼻內滴注法相比，口腔氣管插管術需要一些特殊設備，操作起來也稍有難度。
操作步驟
①腹腔注射***和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：動物必須處于足夠深的麻醉狀態以防止運動或對載體的反應而打噴嚏或**；
②將小鼠放在垂直支架上，將門牙環置于小鼠上門牙上，讓老鼠的腹部面向自己；
③輕輕地把小鼠舌頭拉出來，并用拇指和食指按住，中指放在小鼠頸部和塑料支架之間；
④用食指、拇指在小鼠舌上牽引令其嘴張開，使插管路徑伸直，并用中指在頸后調整頭部角度；
⑤利用光纖作為光源和引導者，推動它通過可視聲帶（如果看不到聲帶，用中指作支撐，輕輕用力拉舌）；
⑥光纖插入后，同時將導管向前推進約5mm，然后勿移動導管，取出光纖；
⑦使小鼠平躺，用膠帶將導管固定在小鼠嘴部防止其移動，另一端用橡皮泥支撐；
⑧用注射器通過導管輸入80μL AAV；
注意：在抽取80μL載體之前，吸取約100μL的空氣至移液管尖，以防止載體的丟失，并促進載體深入肺部。
⑨等待5min，使AAV充分進入下呼吸道；
⑩把導管移出，將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
?將小鼠放回籠中直至完全清醒。
3、氣管內注射
與鼻內滴注相比，氣管內注射能夠提高AAV進入肺部的效率；與口腔氣管插管法相比，設備更簡單，操作更容易。然而，氣管內注射具有極高的外科手術風險，包括出血、切口開裂、感染以及較長的恢復期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，很容易出現操作失誤，將AAV注射到氣管周圍組織或食管中去。
操作步驟
①腹腔注射***和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
②將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上，并將其前爪伸直固定；
③剃除頸部部分區域的鼠毛，并用碘伏做消毒處理；
④用手術剪刀在頸部做一個5~7mm的小切口；
⑤手握鑷子固定住小鼠氣管，另一只手握住注射器，使注射器針頭斜面朝上，與氣管成45°。
注意：一旦針頭插入，輕輕地將針頭向外移動，遠離小鼠身體，確定針頭是否正確地插入氣管。
⑥將40~80μL 的AAV緩慢注入氣管，等待5s后慢慢取出針管；
⑦縫合傷口，將小鼠放回籠中恢復，直到完全清醒。
總結：AAV載體給藥方式應根據研究人員的目標位點和技能進行選擇。
本篇暫為大家分享如上內容，希望對大家的實驗開展有所幫助，下期，小V將從客戶的實際應用效果出發，為您獻上AAV在肺部應用中的靶向策略之應用篇，我們共同學習！
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