細胞骨架是一種網(wǎng)狀的纖維結構，高度動態(tài)，在不同階段呈現(xiàn)不同形態(tài)。它主要由微絲、微管和中間絲組成。微絲主要由肌動蛋白構成，肌動蛋白有兩種形式：單體的球狀肌動蛋白（G-actin）和多聚體的纖維狀肌動蛋白（F-actin）。微絲的組裝涉及G-actin向F-actin的轉化。
鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)七肽，是最早發(fā)現(xiàn)的環(huán)肽之一，從毒鵝膏（Amanita phalloides）中分離出來。它通過結合并穩(wěn)定纖維狀肌動蛋白（F-actin）發(fā)揮作用，并有效防止肌動蛋白纖維的解聚。由于鬼筆環(huán)肽與F-actin的緊密結合和選擇性，它能夠揭示細胞內(nèi)微絲骨架的分布。因此，含有鬼筆環(huán)肽的熒光標記已廣泛用于生物顯微鏡技術中。
Arcegen Biological提供的鬼筆環(huán)肽產(chǎn)品種類繁多，主要根據(jù)使用的不同的熒光團進行區(qū)分，從而在激發(fā)時產(chǎn)生不同的熒光顏色。這有助于在選擇適當?shù)脑O備時滿足激發(fā)和發(fā)射波長的要求，從而在共染色時區(qū)分其他熒光染料的熒光顏色。
實驗程序
鬼筆環(huán)肽的準備
將0.1毫克的鬼筆環(huán)肽溶解在1毫升的無水甲醇中（也可以使用DMSO或無水乙醇溶解），以制備母液，該母液可以在黑暗中長期存放在-20°C的環(huán)境中。工作液濃度為5微克/毫升，是從母液中用PBS稀釋20倍得到的。
染色程序
將細胞用PBS緩沖液沖洗兩次，每次10分鐘。用3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗細胞兩次。加入5微克/毫升的FITC標記鬼筆環(huán)肽，在室溫下進行染色30-60分鐘（夏季時間更短）。用PBS緩沖液沖洗細胞兩次。用DAPI或Hoechst33258染色細胞核10分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗細胞兩次。去除多余的水分，加入熒光封片液（中性或微堿性緩沖液與等量的甘油混合），蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察。
客戶案例
客戶來源：四川大學華西口腔醫(yī)學院
細胞類型：骨髓間充質(zhì)干細胞
比例尺：100微米
參考文獻：Zhu Z, Jiang S, Liu Y, 等. 微米或納米：不同粒徑鎂金屬有機框架-74的生物安全性和生物效能評估。納米研究，2020, 13(2):511-526.
產(chǎn)品介紹：使用的染色產(chǎn)品是FITC標記的鬼筆環(huán)肽，它呈現(xiàn)綠色熒光。該圖像是通過MTT實驗以及FITC標記的鬼筆環(huán)肽和DAPI染色獲得的，用以確定Mg-MOF74對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的安全劑量，確保后續(xù)實驗在安全劑量范圍內(nèi)進行。
細胞類型：骨髓間充質(zhì)干細胞
比例尺：50微米
參考文獻：Fan Z, Xiao L, Lu G, Ding Z, Lu Q. 水溶液中不溶性無定形絲素蛋白支架。生物醫(yī)學材料研究B應用生物材料。2020;108(3):798-808. doi:10.1002/jbm.b.34434
產(chǎn)品介紹：使用的染色產(chǎn)品是羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽，它呈現(xiàn)紅色熒光。圖像顯示了羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色和DAPI核染色，觀察了骨髓間充質(zhì)干細胞在不同再生絲素蛋白支架上分化為內(nèi)皮細胞的情況，使用共聚焦顯微鏡進行觀察。
結論
熒光和生物素標記的鬼筆環(huán)肽衍生物與肌動蛋白抗體相比具有顯著優(yōu)勢。鬼筆環(huán)肽衍生物的結合在不同物種（包括動物和植物）之間保持一致，并且不會因肌動蛋白的變化而受到顯著影響。此外，它們的非特異性染色可以忽略不計，因此在染色和未染色區(qū)域之間形成了高對比度。
注意事項
1. 鬼筆環(huán)肽具有低分子量，能夠輕松穿透細胞，無需預先用冷丙酮或TRITON X-100處理。
2. 它們具有高毒性；因此，在操作時請戴上手套。
產(chǎn)品特點
1. 高親和力：解離常數(shù)Kd為20納摩爾（nM）。
2. 強特異性：選擇性地結合纖維狀肌動蛋白（F-actin），而不結合單體的球狀肌動蛋白（G-actin）。
3. 優(yōu)于抗體染色：鬼筆環(huán)肽不受物種限制，并且表現(xiàn)出極小的非特異性染色，使得染色區(qū)域和未染色區(qū)域之間的對比度非常清晰。
4. 高靈敏度：在納摩爾濃度（nM）下的染色滿足實驗要求。
5. 良好的兼容性和肌動蛋白活性保持：鬼筆環(huán)肽衍生物體積小，直徑約為12-15埃（Å），分子量小于2000道爾頓（Da），這使得標記的肌動蛋白的許多生理特性得以保持。
6. 廣泛的適用性：沒有物種特異性；同樣適用于甲醛固定的和穿孔的組織樣本。
常見問題解答
Q1: 可以在活細胞中進行鬼筆環(huán)肽染色嗎？
A: 鬼筆環(huán)肽染色需要對樣本進行固定和通透化處理，以促進鬼筆環(huán)肽與F-actin之間的結合，從而獲得更好的染色效果。
Q2: 我的細胞樣本已經(jīng)轉染了帶有GFP標簽的質(zhì)粒。我應該選擇哪種鬼筆環(huán)肽？
A: 你可以選擇用TRITC（橙色）、iFluorTM 555（橙色）或iFluorTM 647（遠紅）標記的鬼筆環(huán)肽。
Q3: 染色貼壁細胞需要多少工作液？
A: 染色貼壁細胞只需要足夠的工作液來完全覆蓋細胞。
Q4: 不同的鬼筆環(huán)肽有什么區(qū)別，我該如何選擇？
A: 區(qū)別在于用于標記的熒光團，它們在激發(fā)時會產(chǎn)生不同的熒光顏色。這有助于在共染色時區(qū)分其他熒光染料的熒光顏色。選擇時應基于機器對激發(fā)和發(fā)射波長的要求。
Q5: 鬼筆環(huán)肽染色有物種特異性嗎？
A: 在染色活體動物細胞時沒有物種特異性。
相關產(chǎn)品
|
Product Name |
Catalog Number |
Specifications |
|
Phalloidin |
C331201E |
1 mg |
|
Phalloidin |
C331201S |
5 mg |
|
Amino-Phalloidin |
C331202E |
1 mg |
|
TRITC Phalloidin |
C331207E |
300 T |
|
TRITC Phalloidin |
C331207S |
1 mg |
|
FITC Phalloidin |
C331203E |
300 T |
|
FITC Phalloidin |
C331203S |
1 mg |
|
Fluor 488 phalloidin, Green |
C331204E |
300 T |
|
Fluor 555 phalloidin, Orange |
C331205E |
300 T |
|
Fluor 647 phalloidin, Far Infrared |
C331206E |
300 T |