近日，北京大學劉濤教授課題組在Molecular Cell （IF=17.970）上發表了題為“Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates”的研究論文，文章報道了利用生物正交化學方法，將位點特異性修飾的Cas12a蛋白和5’端化學修飾的crRNA生成共價Cas12a-crRNA復合物（cCas12a），不僅提高了Cas12a系統在哺乳動物細胞中的基因組編輯效率，還能夠用于CAR-T細胞制備中的精確基因敲入和多重基因編輯。本研究為Cas12a系統的廣泛應用奠定了基礎，同時也為改造其它低效的Cas家族成員提供了潛在思路。

針對Cas12a和crRNA的弱結合力問題，研究人員提出了Cas12a與crRNA共價交聯的策略，通過基因密碼子擴展技術在Cas12a核酸酶上定點引入了含有疊氮基團的非天然氨基酸，結合蛋白晶體結構分析，得到位點特異性修飾的Cas12a蛋白，并與5’端DBCO（二苯并環辛炔）修飾的crRNA共價偶聯，生成了有活性的核糖核蛋白復合物（RNP）。此策略將Cas12a和crRNA共價連接成一個組分，RNP復合物可以直接傳遞到細胞中，在到達目標位點之前共價鍵還可以防止復合物解離，安全性及準確性均較高。

Cas12a-crRNA復合物的開發

1、cCas12a的設計與生成

研究表明，Cas12a crRNA的5’端經修飾后活性不會受影響，由此研究人員嘗試將crRNA的5’端與Cas12a共價結合。首先確定了合適的交聯位點為AsCas12a（來自氨基酸球菌屬）蛋白的第806位甲硫氨酸（M806）,并通過非典型氨基酸誘變技術將其替換為含疊氮基團的非天然氨基酸AeF，生成了突變體AzCas12a。經體外DNA切割等實驗檢測證實AzCas12a與WT Cas12a具有相同的的核酸酶活性。隨后，研究人員將5’DBCO修飾的crRNA通過疊氮-炔環加成反應共價連接到AzCas12a，生成了cCas12a RNP復合物，體外DNA切割試驗證實了cCas12a RNP復合物的核酸酶活性。

圖1. 位點特異性疊氮基修飾Cas12a的生成及與5’端修飾crRNA的共價結合

2、CRISPR/cCas12a在哺乳動物細胞中的基因編輯效率大大提高

cCas12a RNP復合物生成后，研究人員對其切割效率進行了驗證：在HEK293-EGFP-Teton細胞中，cCas12a RNP對EGFP基因的編輯效率約是WT Cas12a和非共軛AzCas12a的3倍，而對HEK293細胞中5個內源性基因位點的編輯效率提高了1.6-18.3倍；在3種難轉染細胞（K562、Jurkat和NIH/3T3）中,cCas12a RNP對相關基因的編輯效率也大大提高（2~4倍）。這說明，Cas12a與crRNA共價交聯可以大幅提高不同細胞中不同位點的基因編輯效率。

圖2. CRISPR/cCas12a在哺乳動物細胞中的基因編輯效率大大提高

3、CRISPR/cCas12a脫靶效應的評估

接下來，研究人員對CRISPR/cCas12a的脫靶效率進行了評估。首先，使用GUIDE-seq方法評估了cCas12a和WT Cas12a RNPs對HEK293細胞中三個不同基因位點（hHPRT1、GUK1和DNMT1）的靶效率和脫靶效率。結果表明，cCas12a對3個基因的打靶率增加了2-6倍。此外，cCas12a對hHPRT1和GUK1基因的脫靶切割未檢測到。對于本身脫靶率極高的DNMT1基因，研究人員也確實檢測到了cCas12a對DNMT1的非靶向切割。這些數據表明，cCas12a RNP復合物可以大幅提高基因的靶上編輯效率，而脫靶效應的風險可能取決于crRNA的內在序列特異性。