細胞骨架是一種網狀的纖維結構，它高度動態，并在不同階段展現出不同的形態。它主要由微絲、微管和中間絲組成。微絲主要由肌動蛋白組成，肌動蛋白以兩種形式存在：球狀肌動蛋白（G-actin）和纖維狀肌動蛋白（F-actin）。微絲的組裝涉及G-actin向F-actin的轉變。

圖1. 細胞骨架結構（包括微絲、微管和中間絲）。圖片來源：“醫學細胞生物學：第7章 細胞骨架與細胞運動”。

鬼筆環肽是一種環狀七肽，是最早發現的環肽之一，從毒鵝膏（Amanita phalloides）中分離出來。它通過與纖維狀肌動蛋白（F-actin）結合并穩定其結構，有效地阻止肌動蛋白絲的解聚。由于鬼筆環肽對F-actin具有緊密且選擇性的結合能力，它可以揭示細胞內微絲骨架的分布，因此使用鬼筆環肽進行熒光標記在生物顯微鏡技術中得到了廣泛應用。
 

圖2. 鬼筆環肽的結構

值得注意的是，未修飾的鬼筆環肽不能穿透細胞膜，這使得它在涉及活細胞的實驗中難以直接應用。用FITC（熒光素異硫氰酸酯）和羅丹明等熒光物質標記的鬼筆環肽可以特異性地結合到真核細胞中的F-actin上，從而揭示細胞內微絲骨架的分布。

Arcegen Biosciences提供多種鬼筆環肽產品，主要根據不同的熒光標簽來區分，這些不同的熒光標簽在激發時會產生不同的熒光顏色。這種多樣性滿足了不同機器對激發和發射波長的不同要求，允許在與其他熒光染料共染色時區分不同的熒光顏色。

實驗程序

鬼筆環肽的制備

將0.1毫克的鬼筆環肽溶解在1毫升的無水甲醇（或DMSO或無水乙醇）中，以制備母液。母液可以在黑暗中長期存放在-20°C的環境中。工作濃度為5微克/毫升，可以通過將母液用PBS稀釋20倍來實現。使用前進行稀釋。

染色程序

1. 使用PBS緩沖液沖洗細胞兩次，每次10分鐘；
2. 使用3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗細胞兩次；
3. 在室溫下使用5微克/毫升的FITC標記鬼筆環肽染色細胞30-60分鐘（夏季時間可能更短），然后用PBS緩沖液沖洗細胞兩次；
4. 使用DAPI或Hoechst 33258染色細胞核10分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗細胞兩次；
5. 去除多余的水分，添加熒光封片液（中性或微堿性緩沖液與等量的甘油混合），蓋上蓋玻片，然后在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察。
 

客戶案例

客戶來源：四川大學華西口腔醫院牙科診所

細胞類型：骨髓間充質干細胞

比例尺：100微米

參考文獻：Zhu Z, Jiang S, Liu Y, 等。微米或納米：不同粒徑鎂金屬有機框架-74的生物安全性和生物效能評估。納米研究，2020, 13(2): 511-526。

產品介紹：使用的染色產品是FITC標記的鬼筆環肽，它使細胞呈現綠色熒光。圖像顯示了使用MTT實驗、FITC標記的鬼筆環肽染色和DAPI染色來確定Mg-MOF74對骨髓間充質干細胞的安全劑量，確保后續實驗在安全劑量范圍內進行。

細胞類型：骨髓間充質干細胞

比例尺：50微米

參考文獻：Fan Z, Xiao L, Lu G, Ding Z, Lu Q. 水溶液中不溶性無定形絲素蛋白支架。J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(3):798-808. doi:10.1002/jbm.b.34434

產品介紹：使用的染色產品是羅丹明標記的鬼筆環肽，它使細胞呈現紅色熒光。圖像顯示了羅丹明標記的鬼筆環肽染色和DAPI核染色，觀察骨髓間充質干細胞在不同再生絲素蛋白支架上分化為內皮細胞的情況，使用共聚焦顯微鏡觀察。

總結：熒光和生物素標記的鬼筆環肽衍生物比肌動蛋白抗體具有顯著優勢。鬼筆環肽綴合物的結合在不同物種（包括動物和植物）的肌動蛋白變化中保持不變。此外，它們的非特異性染色可以忽略不計。因此，染色和未染色區域之間的對比度很高。
 

注意事項

鬼筆環肽分子量小，可以輕易穿透細胞，因此不需要對細胞進行冷丙酮或TRITON X-100處理。它具有高度毒性，因此在操作時請戴上手套。

產品特點

高親和力：Kd= 20 nM；

強特異性：選擇性地結合到纖維狀肌動蛋白（F-actin），而不結合單體肌動蛋白（G-actin）；

優于抗體染色：鬼筆環肽沒有物種限制，幾乎無非特異性染色，使得染色和未染色區域之間的對比度極高；

高靈敏度：染色濃度在納摩爾級別（nM）即可滿足實驗要求；

與肌動蛋白活性良好兼容：鬼筆環肽衍生物是小分子，直徑約為12-15Å，分子量小于2000 Da，允許標記的肌動蛋白保持許多生理特性；

廣泛的適用性：沒有物種差異；同樣適用于甲醛固定和通透化的組織樣本。
 

常見問題解答

Q1: 可以在活細胞中進行鬼筆環肽染色嗎？
A：鬼筆環肽染色需要對樣本進行固定和通透化處理，以促進鬼筆環肽與F-actin之間的結合，從而獲得更好的染色效果。

Q2：我的細胞樣本轉染了含有GFP的質粒，我應該選擇哪種鬼筆環肽？
A：你可以選擇用TRITC（橙色）、iFluorTM 555（橙色）或iFluorTM 647（遠紅）標記的鬼筆環肽。

Q3：對于貼壁細胞，每個樣本需要多少工作液？
A：貼壁細胞染色只需要足夠的工作液來完全覆蓋細胞。

Q4：不同類型的鬼筆環肽有什么區別，我該如何選擇？
A：區別在于熒光標簽，會產生不同的熒光顏色。這有助于區分其他共染色熒光染料的熒光顏色。在選擇時，確保機器滿足激發和發射波長的要求。

Q5：鬼筆環肽染色有物種特異性嗎？
A：在染色活體動物細胞時沒有物種特異性。

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