編者按
腎臟是人體的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內代謝產物，同時經重吸收功能保留水份及其他有用物質，如葡萄糖、蛋白質、氨基酸、鈉離子等，以調節水、電解質平衡及維護酸堿平衡。腎臟同時還有內分泌功能，生成腎素、促紅細胞生成素、活性維生素D3、前列腺素、激肽等，又為機體部分內分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機體內環境的穩定，使新陳代謝得以正常進行。
然而，隨著經濟的發展，腎臟相關疾病越來越多，并且藥物的腎毒性也引起了科研人員的重視，因此一個能夠高度模擬體內環境的體外腎臟模型將大大促進這方面研究的進展。而來源于hiPSC的腎類器官模型，包含多種腎臟中的細胞類型，盡可能地模擬了人體內腎臟的細胞結構，大大助力了腎臟相關的疾病建模、遺傳研究和藥物篩選等研究。
今天，我們特別關注一項于2023年8月發表在《Nature Protocols》的經典研究——Directed differentiation of ureteric bud and collecting duct organoids from human pluripotent stem cells，該研究報告了誘導人多能干細胞定向分化為輸尿管芽和腎集合管類器官的培養方法。
一、研究背景
由于缺乏新的有效的腎臟疾病治療方法，在體外建立人體腎臟組織模型是再生腎臟學研究的一個重要挑戰。然而，由于器官結構和功能的復雜性，以及其發育起源來自兩個不同的胚胎學群體：后腎間充質和輸尿管芽（UB），從人多能干細胞（hiPSC）誘導生成腎臟組織具有高度的挑戰性。誘導定向分化的技術已經發展到產生含有腎單位樣結構的腎類器官；最近報道了一種高效實用的生成UB組織的方法。在這里，本文作者描述了一種詳細的分步方案，用于將人多能干細胞分化為具有復雜的形態發育和分化為功能性集合管組織能力的三維UB類器官。
該方法可靠且具有重現性，具有hiPSC和類器官分化基本經驗的技術人員可以很容易地采用該方法生成UB組織，而這些組織后續可用于研究人類腎臟發育、模擬疾病過程等。
二、主要研究成果
1. 將人多能干細胞誘導為UB類器官的方案
圖1 定向分化UB類器官方案的示意圖
研究人員采用逐步方法（如原文圖1a-c所示）來模擬UB類器官生長的正常階段。鑒于UB和后腎間充質（MM）分別起源于體內間介中胚層（IM）的前部和后部，所以在早期階段它們的定向分化策略應該就有所不同。而胚狀體，特別是包括中胚層組織，在發育過程中以頭端到尾端的方式構建，其中前部IM來源于相對早期的祖細胞，而后部IM則由后期的軸向祖細胞形成。因此，從類MM前體生成腎臟類器官的方法最初依賴于延長3-6天的WNT/β-catenin激活期，以模擬后期的環境。
在本研究中，研究人員將hiPSC在含有WNT/β-catenin、FGF、BMP和TGF-β信號通路激活劑的培養基中培養1天，以誘導TBXT+中胚層前體；這些祖細胞隨后通過維甲酸（RA）和FGF通路的激活以及BMP和TGF-β因子的信號傳導抑制而立即分化，形成PAX2+GATA3+原腎IM細胞的效率高達90%。
2、中胚層誘導步驟持續的最佳時間為27-30 小時
圖2 中胚層誘導步驟的持續時間對于腎原IM細胞形成的影響
從第0天到第1天，通過添加含有CHIR（5 μM）、FGF2（25 ng/mL）、BMP4（25 ng/mL）和Activin A（50 ng/mL）的第0天培養基，將hiPSC誘導為間胚層祖細胞。這些祖細胞的快速有效形成對于后期成功誘導分化至關重要，僅在誘導24小時后，細胞通常不完全分散，表明它們尚未完成向中胚層狀態的分化。
在27至30小時之間（通常更接近30小時），細胞已經完全分離并有間充質表型，保留最小的集落樣形態，此時細胞準備進入誘導分化的下一步。若進一步延長到> 34小時也會導致后期分化效率不足。如原文圖2中PAX2和GATA3染色所示。
3、三維細胞球的形成以及鑒定
圖4 三維細胞球的形成
在96孔板中，最初的細胞球在第5天聚集成更大的球體，在第7天時，球體分裂成兩個區域：腎小管（ND）細胞和基質間隙，見原文圖4（a）。此時免疫熒光顯示ND細胞球由表達PAX2和GATA3的細胞組成，見原文圖4（d）。
4、UB類器官的形成及鑒定
圖5 UB類器官在三維培養中的形態變化
原文圖5（a、b、d）為類器官在第7-18天生長形態變化的明場圖片，在第9-14天左下部分也可見分散的細胞，這表明球體基質細胞在基質膠培養中具有彌散的特征。
第14天時UB類器官表現出PAX2、GATA3、LHX1、SOX9和CDH1的彌散性表達，RET由遠端祖細胞特異性表達，染色圖片見原文圖5（c）；第18天時類器官結構更加明顯，明場圖片見原文圖5（d），通過類器官切片免疫熒光染色可觀察到類器官表現出AQP2的表達，見原文圖5（e、f）
5、該研究的應用
由于缺乏有效的體外人體腎臟組織模型而難以促進腎臟疾病的研究，從hiPSC生成腎臟組織及其應用一直是一個熱門的研究領域。對于有hiPSC培養經驗的技術人員來說，該研究的分化UB類器官的方案可靠而有效。該方案可廣泛應用于實驗室，促進人類腎臟的發育、先天性腎臟疾病、電解質穩態的機制和與腎小管相關的病理機制的研究。
三、編者點評
這是一項非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“將人多能干細胞誘導為UB類器官”的學者拜讀，文中提出了誘導分化過程中的詳細步驟，培養基配比，并且在文末還指出了各步驟的質量控制點、可能出現的問題以及解決思路。但是本文著重于誘導分化過程中類器官各種特征的描述，并未對誘導成功的類器官進行功能學鑒定，損失了一定的指導意義。
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