編者按
類器官是成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)形成具有特定結(jié)構(gòu)的組織類似物，與對應(yīng)的器官具有高度相似的組織特性和生理功能。腫瘤類器官能夠很好地保留癌癥患者體內(nèi)腫瘤的組織學(xué)和突變特征，在構(gòu)建腫瘤類器官樣本庫、重建腫瘤微環(huán)境、研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及制定個(gè)性化治療方案和藥物篩選等方面發(fā)揮了重要的作用，但目前仍存在著一些因素限制了腫瘤類器官的進(jìn)一步發(fā)展。
今天，我們一起來分享由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所、環(huán)特生物院士專家工作站專家蔣明教授團(tuán)隊(duì)于2024年1月發(fā)表的綜述性文章——《類器官在癌癥基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用》，該文章綜述了類器官技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用及面臨的挑戰(zhàn)，并對未來腫瘤類器官的發(fā)展方向予以展望。
文章題目：類器官在癌癥基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
雜志：《Tianjin Med J》
發(fā)表時(shí)間：2024年1月, Vol. 52 No. 1
作者：司吳雪蓉，蔣明
單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)中心；浙江大學(xué)國際醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)研究所；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院和國家臨床兒童醫(yī)學(xué)中心消化科；浙江省遺傳缺陷與發(fā)育障礙研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
基金項(xiàng)目：科技部重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2021YFC2501800）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（32270863）
01、研究背景
癌癥是疾病相關(guān)死亡的主要原因之一，全球發(fā)病率正在不斷上升。在傳統(tǒng)的癌癥治療方法中，患有特定類型癌癥的大部分人都會接受類似“一刀切”的標(biāo)準(zhǔn)治療，然而這些治療方法對于不同患者表現(xiàn)有不同的治療效果。癌癥精準(zhǔn)治療是指根據(jù)癌癥和個(gè)體的遺傳特征，為每位患者匹配最準(zhǔn)確、最有效的治療方式。這就需要研究人員在體外構(gòu)建出個(gè)性化腫瘤模型，該模型需要具備與原發(fā)腫瘤相似的遺傳特征，能夠反映患者的疾病進(jìn)展和治療靶點(diǎn)，以更準(zhǔn)確地預(yù)測患者對藥物的反應(yīng)。
與傳統(tǒng)的二維（2D）細(xì)胞系和患者源性異種移植（patient derived xenotransplantation，PDX）模型相比，腫瘤類器官與原始腫瘤的生物學(xué)特征更為相似，因此更有可能準(zhǔn)確地預(yù)測患者對藥物的反應(yīng)。現(xiàn)就類器官技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行闡述。
02、類器官概述
類器官被定義為具有自我更新和自我組織能力的體外三維（3D）細(xì)胞簇，具有類似于體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)和功能，一般從組織駐留干細(xì)胞、祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞發(fā)育而來，其培養(yǎng)過程會受到培養(yǎng)環(huán)境的物理特征、內(nèi)外源信號、起始細(xì)胞類型以及系統(tǒng)條件的影響。目前類器官可用于模擬器官發(fā)育和疾病建模，在基礎(chǔ)研究、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。
1.1 腫瘤類器官的構(gòu)建
腫瘤類器官是3D原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，保留了原始腫瘤的組織學(xué)和突變特征。患者源性腫瘤類器官（patient-derived tumor organoids，PDOs）一般可以通過穿刺活檢和手術(shù)切除腫瘤來構(gòu)建，腫瘤細(xì)胞被包裹在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中，并需要在生長培養(yǎng)基中添加特定的生長因子進(jìn)行培養(yǎng)。
PDOs 的培養(yǎng)方法因腫瘤類型不同而存在差異，目前大多數(shù)腫瘤類器官使用Matrigel水凝膠進(jìn)行培養(yǎng)，該基質(zhì)膠是由小鼠肉瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的膠體蛋白混合物。培養(yǎng)基成分取決于類器官模型的種類，主要包括各種生長因子（R-spondin、Wnt 3A，成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子，Noggin等）、HEPES、GlutaMAX、煙酰胺、B27、小分子抑制劑，以及促進(jìn)類器官生長的各種激素。
類器官構(gòu)建成功與否需要通過HE染色、免疫熒光和基因測序等多個(gè)維度進(jìn)行驗(yàn)證和評估；確定類器官與原始腫瘤的一致性是展開后續(xù)研究的先決條件。
1.2 腫瘤類器官的優(yōu)勢
在癌癥研究中，傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用，但兩種模型均存在一定的缺陷。2D細(xì)胞培養(yǎng)需要耗費(fèi)大量的時(shí)間來建立腫瘤細(xì)胞的連續(xù)傳代，因此不利于維持各種細(xì)胞亞型和親本腫瘤的關(guān)鍵驅(qū)動基因表達(dá)。
細(xì)胞系作為體外選擇的產(chǎn)物，在選擇過程不可避免地會導(dǎo)致腫瘤分子特征的丟失，包括拷貝數(shù)變異、突變和內(nèi)部異質(zhì)性。并且細(xì)胞的單層培養(yǎng)無法模擬體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，而這種相互作用對于信號通路和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，是細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。常用的動物模型包括轉(zhuǎn)基因模型和PDX。
通過基因工程生成的動物模型無法真正模擬人類的致病過程，且該模型的生成也非常耗時(shí)。相比之下，通過將部分新切除的患者腫瘤直接移植到動物模型中構(gòu)建而成的 PDX 模型可更好地保留腫瘤的重要特征。然而，PDX模型需要花費(fèi)較長的時(shí)間來構(gòu)建，才能使其具備較高的移植效率和表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的宿主浸潤特征。細(xì)胞系和PDX的衍生效率較低，不能為大規(guī)模的個(gè)體化治療做出貢獻(xiàn)。
此外，這兩種模型通常來自晚期腫瘤，因此其不能完全捕獲癌癥發(fā)展全過程的生理特征。PDOs是在手術(shù)切除后最初幾周內(nèi)由腫瘤構(gòu)建產(chǎn)生的，其最大的優(yōu)勢是可以有效地保留患者的遺傳和表型異質(zhì)性。與使用含血清培養(yǎng)基的2D培養(yǎng)細(xì)胞系相比，原發(fā)性腫瘤類器官細(xì)胞在多次傳代中積累的遺傳變異較少。3種模型在腫瘤建模和藥物篩選中的特點(diǎn)見表1。
表1 2D細(xì)胞系、PDX和PDOs在腫瘤建模和藥物篩選中的特點(diǎn)
03、類器官在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
類器官不僅保留了與體內(nèi)器官高度相似的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，而且在預(yù)測抗癌藥物方面具有極高的臨床相關(guān)性，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化等方面，包括腫瘤類器官樣本庫、腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建，腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究及個(gè)性化藥物篩選，見圖1。
圖1 類器官在癌癥基礎(chǔ)研究及臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
2.1 構(gòu)建腫瘤類器官樣本庫
類器官生物庫作為一種“活體庫”，可以為基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究持續(xù)提供患者來源的樣本，同時(shí)保留腫瘤組織的生物學(xué)特性。
與傳統(tǒng)的生物樣本庫相比，類器官生物庫應(yīng)用范圍更廣泛，尤其是在腫瘤生物標(biāo)志物篩選、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、耐藥機(jī)制研究和藥物療效評價(jià)等方面。Petersen等發(fā)現(xiàn)ECM凝膠可用于培養(yǎng)正常人乳腺上皮細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞后，隨著3D培養(yǎng)技術(shù)的革新和培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，越來越多患者來源的腫瘤被用于構(gòu)建類器官生物庫。
目前，研究人員已成功培養(yǎng)了多種腫瘤類器官，包括結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等。腫瘤具有一定的異質(zhì)性，包括腫瘤間異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性會隨著病程的發(fā)展而加劇，從而導(dǎo)致患者對治療的敏感性及預(yù)后情況不同。因此，全面了解腫瘤的異質(zhì)性對于制定有效的治療策略至關(guān)重要。
目前，已成功構(gòu)建的乳腺癌、胃癌 、腎癌、肺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移等類器官生物庫均被證明很好地維持了患者內(nèi)和患者間的腫瘤異質(zhì)性，同時(shí)還保留了原始腫瘤的組織病理學(xué)和遺傳學(xué)特征。部分腫瘤如胸腺瘤、間皮瘤、橫紋肌肉瘤、胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)病較為罕見，缺乏可以有效進(jìn)行藥物篩選的臨床前模型，阻礙了新型療法的開發(fā) 。因此，這類腫瘤類器官庫的成功構(gòu)建將能夠加速抗癌藥物的研發(fā)。
綜上所述，類器官生物樣本庫可以作為臨床前細(xì)胞培養(yǎng)模型，為基礎(chǔ)癌癥研究、藥物篩選和個(gè)性化醫(yī)療提供一系列具有代表性特征的模型。
2.2 重建腫瘤微環(huán)境
腫瘤微環(huán)境指的是腫瘤中存在的非癌細(xì)胞及它們產(chǎn)生釋放的因子，其主要通過循環(huán)和淋巴系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞相互作用，進(jìn)而影響癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。癌癥免疫療法正迅速成為許多癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方式，但患者的應(yīng)答反應(yīng)主要取決于癌癥的類型和腫瘤靶分子的表達(dá)，這正是由于微環(huán)境的作用導(dǎo)致某些腫瘤細(xì)胞對免疫療法產(chǎn)生了一定的抗性。許多研究都構(gòu)建了癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，通過在體外模擬腫瘤微環(huán)境來探究細(xì)胞間的交互作用，這對于癌癥治療的研究具有重要意義。
通過氣液界面交互技術(shù)植入天然免疫細(xì)胞后得到的PDOs 不僅準(zhǔn)確保留了原始腫瘤的胞受體譜，還能模擬免疫檢查點(diǎn)阻斷過程。 T細(xì)除免疫細(xì)胞外，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）作為活化的成纖維細(xì)胞，能夠產(chǎn)生和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，是腫瘤基質(zhì)中最重要的細(xì)胞類型之一。
許多研究者將腫瘤類器官與相應(yīng)患者來源的CAFs共培養(yǎng)，以探究CAFs在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用。Tsai等在人胰腺癌類器官和CAFs共培養(yǎng)模型中觀察到了肌成纖維細(xì)胞樣CAFs的活化與淋巴細(xì)胞的浸潤。Luo等發(fā)現(xiàn)在未添加生長因子的情況下，CAFs能夠維持水凝膠中結(jié)直腸癌PDOs的增殖。Schuth等同樣發(fā)現(xiàn)CAFs促進(jìn)了原代胰腺導(dǎo)管腺癌類器官的增殖，且類器官中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)增加。
在有些腫瘤的發(fā)生過程中，內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)揮著一定的作用。Lim等利用水凝膠系統(tǒng)建立了共培養(yǎng)模型以模擬和表征體外肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的血管分泌信號，從而探究內(nèi)皮細(xì)胞在肝細(xì)胞癌發(fā)展過程中起到的作用。這些共培養(yǎng)系統(tǒng)有望促進(jìn)腫瘤-微環(huán)境相互作用的研究，但這些模型仍在發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建是否對傳統(tǒng)和新型研發(fā)藥物具有耐藥性，是否可以用于優(yōu)化體外治療反應(yīng)，還需要更多的研究來證明。
2.3 研究腫瘤的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制
基因組DNA序列的異常改變是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的重要原因。近年來，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)引起廣泛關(guān)注，許多研究人員將其與類器官培養(yǎng)相結(jié)合，從而探究特定基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用。
Lo等對人胃類器官進(jìn)行了ARID1A的敲除，Dekkers等在乳腺祖細(xì)胞中敲除了4個(gè)乳腺癌相關(guān)的腫瘤抑制基因。Liu等從患者活檢組織中生成了組成型Wnt激活的人巴雷特食管類器官模型，這些類器官在經(jīng)過基因編輯后均表現(xiàn)出與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的現(xiàn)象，如更高的增殖復(fù)制能力、更少的細(xì)胞凋亡及黏液分化等。Takeda等同樣通過對類器官進(jìn)行基因編輯評估了單個(gè)基因（Apc和Kras）突變在結(jié)直腸癌中的致瘤能力，最終發(fā)現(xiàn)Acvr1b，Acvr2a和Arid2可以作為結(jié)直腸癌的腫瘤抑制基因，并揭示了Trp53在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。
此外，利用癌基因轉(zhuǎn)化類器官模擬人體治療過程，可以為耐藥治療提供更有效的信息，這樣不僅可以建立腫瘤模型，還可以研究特定基因突變對藥物的治療反應(yīng)。Verissimo等發(fā)現(xiàn)引入致癌 Kras 突變的正常結(jié)腸類器官對EGFR-RAS-ERK 通路靶向抑制劑的藥物反應(yīng)譜與RAS突變的結(jié)直腸癌類器官一致。這可能有助于證明相關(guān)突變基因?qū)λ幬锓磻?yīng)的影響，并排除如細(xì)胞狀態(tài)、其他癌癥突變的存在等復(fù)雜因素的干擾。
2.4 制定個(gè)性化治療方案及藥物篩選
個(gè)性化腫瘤模型的制定是開發(fā)個(gè)性化治療方案的前提，研究人員發(fā)現(xiàn)類器官可以很好地保留患者體內(nèi)腫瘤的特征，且微環(huán)境中殘留的免疫細(xì)胞如腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞，可以用來評估相應(yīng)腫瘤類器官的殺傷效率。
利用微流體技術(shù)從患者腫瘤組織中快速生成的微器官球能保留大部分原始腫瘤駐留免疫細(xì)胞，且PD-1阻斷和雙特異性抗體等免疫療法可以激活TILs以攻擊MOS內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。Dijkstra等則證明自體腫瘤類器官和外周血淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)可以用來富集錯(cuò)配修復(fù)缺陷的結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌患者外周血來源的TILs。實(shí)現(xiàn)構(gòu)建個(gè)性化模型后的關(guān)鍵問題在于類器官能否準(zhǔn)確預(yù)測出藥物在患者體內(nèi)的反應(yīng)。大量研究表明抗腫瘤藥物在類器官中的反應(yīng)與患者體內(nèi)反應(yīng)一致，且經(jīng)類器官篩選得到的藥物在患者體內(nèi)也具有一定的療效，這些在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和胃食管癌中均已得到證實(shí)。
利用類器官進(jìn)行藥物篩選具有篩選周期短、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，對指導(dǎo)患者用藥和臨床試驗(yàn)，以及加快抗癌藥物的研發(fā)具有重要作用。目前已經(jīng)建立了一些相對成熟的類器官高通量藥物篩選平臺，利用PDOs可以在1周內(nèi)完成藥物篩選，具有較高的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值。但類器官中腫瘤微環(huán)境的不完全保留會限制其篩選免疫檢查點(diǎn)抑制劑和抗血管生成類藥物，且在基于癌癥類器官藥物篩選更廣泛地應(yīng)用于個(gè)性化治療之前，還需要進(jìn)一步評估其對不同癌癥類型的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和適用性。
04、研究困境與挑戰(zhàn)
雖然多項(xiàng)研究證明，類器官在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中具有廣泛的應(yīng)用，具備高度的臨床相關(guān)性，能夠有效地對患者進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，使個(gè)體化的精準(zhǔn)腫瘤治療成為可能。但類器官技術(shù)仍處于發(fā)展的早期階段，許多因素限制了該技術(shù)的應(yīng)用。首先，腫瘤微環(huán)境的 ECM 組成成分比僅富含層黏連蛋白或透明質(zhì)酸的 ECM凝膠復(fù)雜，目前所構(gòu)建的PDOs中腫瘤細(xì)胞-ECM間的相互作用還過于簡單，且存在于原代PDOs中的基質(zhì)細(xì)胞在長期培養(yǎng)過程中會逐漸丟失。
盡管已經(jīng)開發(fā)了許多共培養(yǎng)體系，但仍然無法非常準(zhǔn)確地復(fù)制出患者體內(nèi)的微環(huán)境。因此，用體外構(gòu)建的PDOs進(jìn)行藥物篩選與體內(nèi)療效的一致性仍需進(jìn)一步探究。除微環(huán)境成分的缺乏，類器官還缺乏血管結(jié)構(gòu)，由于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞間的擴(kuò)散距離有限，類器官體積的增加易導(dǎo)致中心細(xì)胞的死亡。其次，由于生長因子和基質(zhì)膠的成本較高，類器官的培養(yǎng)成本遠(yuǎn)高于2D培養(yǎng)細(xì)胞系，且培養(yǎng)過程更耗時(shí)，培養(yǎng)技術(shù)難度大。
目前，雖然已顯示出將類器官技術(shù)用于非上皮癌的可行性，但該技術(shù)主要用于生成起源于上皮的惡性腫瘤。再者，類器官培養(yǎng)過程中，生長因子條件培養(yǎng)基中需要有小鼠來源的基質(zhì)膠、胎牛血清等動物來源產(chǎn)品，因此無法直接實(shí)現(xiàn)臨床上的轉(zhuǎn)化，且這些提取物的組成存在批次間的差異，可能會影響實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。
最后，類器官的培養(yǎng)純度也十分關(guān)鍵，正常類器官的過度生長易造成腫瘤類器官的污染，有時(shí)僅添加與腫瘤類器官相關(guān)的生長因子能夠在一定程度上抑制正常類器官的生長。
05、小結(jié)與展望
類器官在近十幾年間迅速發(fā)展，已在發(fā)育生物學(xué)、癌癥前臨床研究等領(lǐng)域取得了許多突破，如發(fā)現(xiàn)基因序列與抗癌藥物敏感性間的關(guān)系，體外模擬腫瘤及其微環(huán)境以實(shí)現(xiàn)藥物篩選，新型藥物的研發(fā)和免疫療法的評估等。腫瘤類器官在具備一定優(yōu)勢的同時(shí)又有一些限制，但隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，類器官將能夠更好地模擬人類腫瘤的特征并預(yù)測藥物反應(yīng)，從而避免臨床過度治療及不良反應(yīng)，有利于提升精準(zhǔn)治療的水平，在腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化方面做出更大的貢獻(xiàn)。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及多種癌種的類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！
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