NAT COMMUN（IF17.694）｜南京醫科大學附屬兒童醫院團隊發現DNA-PKcs有望成為慢性腎臟病治療新靶點！
慢性腎臟疾病(CKD)困擾著全世界10%的成年人，目前尚無有效的治療方法，腎間質纖維化是該病的主要病理特征之一。新近的研究表明，腎損傷引起腎細胞發生代謝重編程，主要表現為腎小管上皮細胞去分化和肌成纖維細胞激活，這種代謝重編程促進免疫細胞浸潤和間質纖維化，并促進CKD的發展。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）的慢性激活可促進各種病理條件下的代謝重編程，但其調節間質纖維化激活的機制在很大程度上仍然未知。 2023年3月11日，南京醫科大學附屬兒童醫院張躍/黃松明/賈占軍/張愛華團隊在Nature Communications?(IF?17.694)發表題為“DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) drives chronic kidney disease progression in male mice”的文章。 在這項研究中，研究人員發現在慢性腎臟病（CKD）患者以及雄性小鼠單側輸尿管梗阻（UUO）和單側缺血再灌注（UIR）損傷誘導的腎臟組織中DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基DNA-PKcs的表達均顯著升高，體內外抑制DNA-PKcs可糾正CKD中受損上皮細胞和肌成纖維細胞的代謝重編程。機制上，DNA-PKcs在CKD中通過磷酸化TATA-box結合蛋白相關因子7 (TAF7)介導RAPTOR/mTORC1信號的激活。因此，在CKD中可以通過TAF7/ mTORC1信號通路抑制DNA-PKcs以糾正代謝重編程，并作為治療CKD的潛在靶點。 基因信息 DNA依賴性蛋白激酶催化亞基， 病毒產品 AAV8-U6-gRNA-DNA-PKcs； AAV8-U6-gRNA 實驗動物 6-8周齡雄性Kap+Cas9+小鼠 病毒用量 5×10E11 GC 注射方式 腎包膜下注射 
DNA-PKcs
1 研究結果
1、DNA-PKcs介導小鼠CKD進展
實驗驗證DNA-PKcs在CKD患者和腎纖維化小鼠的腎臟中表達上調。作者構建了DNA-PKcs敲除小鼠，并給予小鼠UUO處理，與WT小鼠相比，DNA-PKcs的敲除明顯改善了UUO誘導的腎小管結構障礙及腎纖維化，同時顯著降低UUO誘導的炎性細胞因子上調。UUO造成了WT小鼠梗阻腎內巨噬細胞的大量浸潤，而DNA-PKcs敲除后巨噬細胞浸潤明顯減少。接著，作者將靶向DNA-PKcs的AAV8-sgRNA以腎包膜下注射的方式注入Kap+ Cas9+ 小鼠腎臟，進一步構建了近端腎小管上皮細胞DNA-PKcs特異性敲除小鼠（DNA-PKcsTEC KO），3周后進行UUO手術，Western blot分析顯示，DNA-PKcsTEC KO小鼠腎臟中DNA-PKcs和促纖維化標志物蛋白水平顯著降低。與UUO模型類似，DNA-PKcs敲除小鼠也能免受UIR誘導的CKD。這些結果表明，DNA-PKcs缺失可以減弱小鼠CKD進展。
圖1. DNA-PKcs缺失減弱了小鼠CKD進展
2、體內給藥DNA-PKcs抑制劑NU7441可減弱小鼠CKD進展
基于上述結果，作者假設DNA-PKcs抑制劑可以用于預防腎纖維化。對進行UUO手術的WT小鼠每天給予DNA-PKcs高特異性抑制劑NU7441治療，免疫組化染色分析顯示NU7441的給藥顯著抑制UUO腎組織DNA-PKcs的激活，并且NU7441處理后UUO誘導的腎小管結構障礙和腎間質纖維化均得到明顯改善；與對照相比，NU7441處理后UUO小鼠腎組織巨噬細胞浸潤也顯著減少。此外，作者發現NU7441在DNA-PKcs敲除小鼠中沒有明顯的抗纖維化作用，表明NU7441對DNA-PKcs具有特異性作用。同樣地，NU7441治療也能改善UIR誘導的腎損傷和纖維化。這些結果表明，NU7441抑制DNA-PKcs活性，可以減弱小鼠CKD進展。
圖2. DNA-PKcs抑制劑NU7441的處理可減弱小鼠CKD進展
3、體外抑制DNA-PKcs活性可保護腎小管上皮細胞表型，調節間質成纖維細胞激活
腎損傷會引起腎小管上皮細胞去分化和肌成纖維細胞激活，這是CKD發病機制中的核心事件。TGF-β1是間質纖維化的關鍵介導因子，作者發現在TGF-β1處理的HK-2細胞中，DNA-PKcs磷酸化水平和總蛋白水平顯著上調，進一步研究表明，敲除DNA-PKcs或添加NU7441抑制劑均可以改善TGF-β1誘導的腎上皮細胞去分化。不僅如此，TGF-β1處理也上調了腎成纖維細胞（NRK-49F）中的DNA-PKcs磷酸化和總蛋白水平。免疫染色顯示，在NRK-49F細胞中，TGF-β1處理顯著誘導DNA-PKcs活性，促進成纖維細胞激活和肌成纖維細胞分化，而NU7441處理則得到了與之相反的結果。這些數據表明，抑制DNA-PKcs可以保護腎小管上皮細胞表型，并調節間質成纖維細胞激活。
圖3. 體外抑制DNA-PKcs可以保護腎小管上皮細胞表型，調節間質成纖維細胞激活
4、DNA-PKcs通過TAF7介導的RAPTOR表達上調促進mTORC1的激活
作者證實DNA-PK通過介導TAF7磷酸化加重腎纖維化，為了進一步探討TAF7的促纖維化作用機制，研究人員進行了RNA-Seq。相關分析表明，TGF-β1處理后mTOR信號通路顯著上調，而TAF7敲除后mTOR信號通路則明顯下調。同時，TGF-β1處理還增加了mPTC細胞中mTORC1磷酸化水平及其正調節因子RPTOR (RAPTOR)的蛋白水平，而敲除TAF7后則與之相反。此外，作者發現無論是過表達DNA-PKcs還是TAF7，RPTOR蛋白水平和mTOR磷酸化水平均升高。這些結果表明DNA-PKcs介導的TAF7磷酸化通過上調RPTOR的表達來促進mTORC1的激活。
圖4. DNA-PKcs通過TAF7介導的RAPTOR表達上調促進mTORC1的激活
5、抑制DNA-PK或TAF7可以糾正腎細胞代謝重編程
先前的研究表明，mTORC1的異常激活通過介導纖維化腎的代謝重編程促進腎纖維化的進展，因此作者研究了抑制DNA-PK或TAF7是否能糾正纖維化腎臟的代謝重編程。通過對TGF-β1處理的NC和TAF?/?mPTC細胞進行RNA-Seq分析，作者發現代謝信號通路是兩種mPTC細胞之間表達差異最大的通路之一。與NC對照細胞相比，TAF7敲除mPTC細胞經TGF-β1處理后氧化磷酸化和脂肪酸氧化途徑顯著上調，糖酵解途徑顯著減少，表明TAF7缺失可以糾正TGF-β1誘導的mPTC細胞代謝重編程。另一方面，敲除DNA-PKcs可明顯改善UUO誘導的WT小鼠氧化磷酸化和脂肪酸代謝異常，并抑制糖酵解途徑。最后，使用代謝組學分析進一步說明抑制DNA-PK或TAF7可以糾正由損傷或TGF-β1引起的腎細胞代謝重編程。
圖5. 抑制DNA-PK或TAF7可以糾正代謝重編程
2 結論
本研究發現DNA-PKcs通過磷酸化TAF7介導RAPTOR/mTORC1信號的激活，并糾正受損上皮細胞和肌成纖維細胞的代謝重編程，表明靶向DNA-PKcs可能是治療慢性腎臟疾病的潛在治療策略。
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