編者按
姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖，姜黃葉提取物是從傳統中藥姜黃中提取的主要天然成分，研究表明其具有抗炎、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、維護心血管健康等多種作用。近年來，其抗氧化作用備受研究者關注。
過量產生活性氧（ROS）引起的氧化應激會導致細胞損傷。因此，具有抗氧化特性的功能材料對維持氧化還原平衡至關重要。已有多項研究表明姜黃葉具有抗氧化特性，姜黃葉的抗氧化作用來源于不同的生物活性化合物，如姜黃素、總酚類化合物和黃酮類化合物等。
今天，我們分享2021年1月由韓國食品研究院、高麗大學研究團隊發表的一項研究成果，該研究利用體外Vero細胞與斑馬魚模型評估了姜黃葉提取物（TLE）對ROS生成、細胞凋亡的影響，并對姜黃葉提取物（TLE）中功能化合物的組成進行鑒定，發現姜黃葉提取物具有較強的抗氧化作用，其作用機制是通過抑制H2O2誘導的體外和體內活性氧的產生發揮作用，因此，姜黃葉提取物可能用以抗氧化劑的食物來源，適合用于功能性食品或作為氧化應激誘導的細胞損傷的替代治療。
文章題目
Antioxidant Effects of Turmeric Leaf Extract against HydrogenPeroxide-Induced Oxidative Stress In Vitro in Vero Cells and InVivo in Zebrafish
雜志：Antioxidants（IF=6.3）
發表時間：2021年1月14日
作者：Kim M, Kang M C, et al．
單位：韓國食品研究院、高麗大學（Korea University）等
01、研究背景
活性氧（ROS），即在細胞代謝過程中產生的多種不同的含氧活性分子，可導致氧化應激，損傷包括蛋白質、DNA和脂質在內的必需大分子，從而改變生物活性。一般來說，ROS的產生是由ROS的產生和清除之間的平衡決定的，這被稱為氧化還原平衡或氧化還原自穩態。然而，病理狀態下，在外界刺激暴露后，氧化-抗氧化平衡可能會被破壞，隨著ROS的累積產生氧化應激，觸發炎癥、細胞凋亡和自噬等多種病理過程，甚至導致癌癥、心血管疾病、神經紊亂和糖尿病等各種疾病的發生。因此，需要補充抗氧化劑來維持氧化還原平衡，并防止由ROS失衡引起的氧化應激引起的疾病。
姜黃（Curcuma longa L.，姜科）是一種常見的草本植物，在印度、中國等許多亞洲國家都有種植。自古以來，姜黃一直被作為藥用植物，其具有多種生物活性，如增強免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌和傷口愈合等。這些功能特性源于姜黃的主要成分——姜黃素類化合物，包括姜黃素、脫甲氧基姜黃素、雙脫甲基姜黃素等。
姜黃素作為眾所周知的黃色色素，其清除自由基的活性較強，是一種潛在的能緩解氧化應激引起的細胞損傷的活性物質。同樣，姜黃葉作為姜黃的副產品，被認為也具有抗氧化特性，并在東南亞的各種菜肴中被用作食材。然而，除了收獲后的動物飼料外，姜黃葉大多被浪費為副產品。然而，除了被用作動物飼料外，姜黃葉大多作為副產品。已有研究表明，姜黃葉也含有生物活性化合物，如姜黃素、多種酚類化合物和黃酮類化合物，這些化合物因其能夠有效地清除自由基活性而被認為具有抗氧化作用。然而，姜黃葉對ROS誘導的氧化應激的影響尚不清楚。
本研究通過對姜黃葉提取物（TLE）中功能化合物的組成進行鑒定，并采用Vero細胞、斑馬魚模型分別在體外和體內水平研究其對ROS生成和細胞凋亡的影響，旨在評估姜黃葉提取物（TLE）對過氧化氫（H2O2）誘導的氧化應激的影響。
02、研究結果
1. 對姜黃葉提取物中黃酮類物質進行鑒定
采用高效液相-質譜聯用(HPLC-MS)對姜黃葉提取物（TLE）中的黃酮類化合物進行分析，鑒定出10種黃酮類化合物，分別為：香葉木素diosmetin （525.40±0.23 ng/mg）、槲皮苷quercitrin （304.94±7.95 ng/mg）、蘆丁rutin （118.33±6.72 ng/mg）、miquelianin （111.38±6.57 ng/mg）、花旗松素taxifolin （92.14±5.06 ng/mg）、myrictrin （63.73±2.31 ng/mg）、葛根素puerarin （55.30±4.56 ng/mg）、蕓香柚皮苷narirutin （25.81±1.44 ng/mg）、柚皮苷naringin（25.81±1.44 ng/mg）、槲皮苷quercetin（23.31±0.44 ng/mg）（圖1）。
圖1.（a）黃酮類化合物的提取離子色譜圖（EIC）和（b）4 mg/mL提取物中三種主要黃酮類化合物的化學結構
2. TLE對細胞活力的影響
采用MTT法測定姜黃葉提取物（TLE）對H2O2處理的Vero細胞活力的影響。如圖2所示，未處理細胞的細胞活力為100%，H2O2處理組的細胞活力降至78.4%，而TLE處理組的細胞活力均高于H2O2處理組，而且，與未處理組相比，細胞活力為86.3%。這表明，姜黃葉提取物（TLE）對H2O2誘導的Vero細胞無細胞毒性，并抑制了H2O2誘導的細胞死亡。
圖2. H2O2處理的Vero細胞存活率
3. TLE對Vero細胞內ROS生成的影響
采用DCFH-DA法測定H2O2處理的Vero細胞內ROS的清除能力。與未處理組相比，600μM的H2O2處理組ROS生成量增加了約7.4倍（圖3），而除10μg/mL處理外，TLE處理組的各濃度均顯著降低Vero細胞內ROS生成量，且呈劑量依賴效應。特別是相比于H2O2處理組（100%），最高濃度的TLE（100μg/mL）表現出最強的ROS清除活性，其清除率達到52.6%，這表明TLE具有顯著的自由基清除活性，能有效抑制H2O2處理的Vero細胞內的ROS的產生。
圖3. H2O2處理的Vero細胞內活性氧（ROS）的生成
4. TLE對Vero細胞Sub-G1期細胞群的影響
為確認DNA片段化的程度，研究人員采用碘化丙啶（PI）DNA染色法對Sub-G1期細胞群進行流式細胞術細胞周期分析，發現未處理組的Sub-G1期細胞群為0.4%，而H2O2處理后的sub-G1期細胞比例高達24.7%。與對照組的Sub-G1期細胞群相比，不同濃度的TLE處理組顯著降低，分別為19.7%、10.6%、9.3%和6.3%，且呈劑量依賴性效應（圖4）。這些結果表明，TLE具有抗氧化作用，能夠有效地抑制DNA破碎和凋亡。
圖4. H2O2處理的Vero細胞Sub-G1期細胞的比例
5. TLE處理對H2O2誘導的Vero細胞凋亡的影響
通過Hoechst 33342和PI的核染色，評估TLE處理對H2O2誘導的Vero細胞凋亡及DNA片段的影響。如圖5所示，未處理組的細胞核未出現損傷，而H2O2處理的細胞與核濃縮增加，其Hoechst 33342染色呈藍色熒光；PI呈紅色熒光，出現細胞死亡；而10µg/mL和100µg/mL的TLE處理組顯著降低了H2O2誘導的細胞核濃縮和細胞死亡。這些結果表明，TLE處理能夠抑制H2O2誘導的氧化應激造成的Vero細胞凋亡。
圖5. 雙染色的Vero細胞熒光顯微鏡圖像
6. TLE對H2O2誘導的斑馬魚細胞死亡、ROS生成和脂質過氧化的抑制作用
為了驗證TLE對H2O2誘導的氧化應激的影響，研究人員采用斑馬魚損傷模型對斑馬魚細胞死亡、ROS生成和脂質過氧化進行評價，并通過吖啶橙熒光染色檢測法評估了TLE對H2O2誘導的斑馬魚細胞死亡的保護作用。將H2O2處理的斑馬魚細胞死亡率看作100%，100μg/mL、200μg/mL的TLE處理顯著降低了H2O2誘導的斑馬魚細胞死亡率，分別為40.0%和16.7%（圖6a）。
采用DCFH-DA法測定TLE對H2O2處理的斑馬魚胚胎中ROS的生成，將H2O2處理的斑馬魚ROS生成看作100%，100μg/mL、200μg/mL的TLE處理顯著降低了H2O2處理的斑馬魚體內ROS的生成，分別為51.0%和72.6%（圖6b）。
采用測量DPPP熒光強度研究TLE對H2O2處理的斑馬魚體內脂質過氧化程度，發現100μg/mL、200μg/mL的TLE處理顯著降低了H2O2處理的斑馬魚體內脂質過氧化，分別為20.9%和6.7%，且呈濃度依賴性（圖6c）。這些結果表明，TLE對H2O2誘導的斑馬魚氧化應激具有保護作用。
圖6. 斑馬魚細胞死亡、ROS生成和脂質過氧化
03、編者點評
綜上所述，該研究表明，姜黃葉提取物具有很強的抗氧化作用，其作用機制是通過抑制H2O2誘導的體外Vero細胞與斑馬魚ROS的產生發揮作用。因此，姜黃葉可能是一種抗氧化劑的食物來源，適合用于功能性食品或作為氧化應激誘導的細胞損傷的替代療法。
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