大家好，我是你們的實驗助手。在上一期中，我們討論了檢測細胞凋亡的各種方法。在這一期內，我們將專注于用于檢測細胞凋亡的TUNEL實驗，并分析實驗中TUNEL染色結果失敗的原因。首先，我們來了解TUNEL染色過程的步驟，如下圖所示。

圖1. TUNEL染色程序（注：核染色步驟是可選的）

在使用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡時，需要使用蛋白酶K、熒光素-dUTP、末端脫氧核糖核酸轉移酶（TdT酶）等各種試劑。此外，還需要設置陽性和陰性對照組。面對復雜的染色步驟，許多人都表示感到困惑。下面，我們將逐一提供答案。

TUNEL檢測試劑盒的主要組成成分及其功能

1) 平衡緩沖液：用于維持一定的反應條件，緩沖液中的Mg2+可以減少背景噪聲，而Mn2+則增強染色效率。

2) 蛋白酶K：滲透細胞膜和核膜，確保TUNEL探針能夠進入細胞并確保足夠的染色。

3) 熒光素-dUTP：標記3'-OH末端，作為TdT酶的底物。

4) TdT酶：關鍵酶，催化將dUTP標記在3'-OH末端。

陽性對照組、陰性對照組、實驗組

1) 陽性對照組：用DNase酶處理以誘導細胞凋亡并暴露3'-OH末端。每個實驗準備一個樣本。

2) 陰性對照組：不添加TdT酶，其他步驟與實驗組相同。每種類型的組織樣本需要一個陰性對照。例如，如果有5個來自小鼠的肺組織切片，那么就需要5個陰性對照樣本。

3) 實驗組：除了陽性和陰性對照組之外，所有其他樣本都被視為實驗組。

為什么要設置陽性對照組和陰性對照組

1) 陽性對照組：用于驗證實驗步驟和試劑盒是否存在問題。

2) 陰性對照組：a. 排除由于細胞凋亡和實驗過程本身等原因引起的非特異性染色。b. 在成像過程中調整曝光強度。

此外，人們可能會遇到各種染色結果的問題，包括熒光信號弱、無熒光信號、假陽性高、熒光背景強等。染色失敗的主要原因包括樣本處理不當、染色不足、曝光時間過長等。這些問題可以從以下幾個方面進行分析和解決。

熒光信號弱或缺失

如果已知細胞或組織樣本處于凋亡狀態，但在使用TUNEL試劑盒時發現熒光信號弱或缺失。

4.1 樣本處理不當
1) 樣本切片太厚。建議稍微切薄切片以獲得更好的染色效果。

2) 去石蠟和水化不充分。建議在60°C下去石蠟20分鐘，然后使用二甲苯兩次，每次5-10分鐘；水化時使用從高到低濃度的乙醇梯度。

3) 蛋白酶K孵育時間太短。優化蛋白酶K的孵育時間，通常使用的時間為10-30分鐘。大約4微米的切片通常孵育10分鐘，而大約30微米的切片孵育30分鐘。

4) 蛋白酶K濃度太低。建議使用20微克/毫升的工作濃度的蛋白酶K。

5) 切片在-20°C下存放時間過長可能不夠新鮮，降低了染色效率。建議使用新鮮的切片。
 

4.2 染色步驟不當
6) 染色時間太短。建議在37°C下孵育60分鐘，根據凋亡損傷的程度，可以延長至2小時，但要注意背景染色。

7) TdT酶或熒光標記的dUTP濃度太低。建議適當增加TdT酶或熒光標記的dUTP的濃度。

8) TdT酶失活。建議在使用前立即準備TUNEL反應溶液，并短暫存放在冰上。長時間存放可能導致TdT酶失活。

9) 樣本干燥。加入TUNEL反應溶液后，用蓋玻片/膜/濕盒覆蓋玻片，以確保樣本均勻染色，并防止反應溶液干燥。
 

4.3 熒光檢測步驟不當
10) 操作時沒有避光。由于熒光的脆弱性，建議在標記和檢測樣本時避免光線照射，并盡快進行觀察。

非特異性染色（假陽性率高）

如果已知細胞或組織樣本仍然處于活細胞狀態，但使用TUNEL試劑盒時卻發生了非特異性染色，顯示出與處理過的樣本相似甚至比陽性對照組的熒光信號更強的熒光信號。

5.1 樣本處理不當
1) 使用酸性或堿性固定液可能會導致DNA損傷。建議使用中性pH值的固定液來固定組織或細胞。

2) 固定液濃度過高可能會導致細胞自溶，DNA鏈不規則斷裂，引起假陽性。建議使用4%的多聚甲醛溶液（溶于PBS中）。

3) 固定時間過長可能會導致細胞自溶，DNA鏈不規則斷裂，引起假陽性。建議將固定時間控制在4°C下25分鐘。

4) 蛋白酶K處理時間過長可能會破壞核酸結構，導致假陽性。建議適當縮短處理時間。

5) 蛋白酶K濃度過高可能會破壞核酸結構，導致假陽性。建議適當調整蛋白酶K溶液的濃度，一般工作濃度為20微克/毫升。
 

5.2 染色步驟不當
6) TUNEL染色時間過長。通常建議在37°C下孵育60分鐘，根據凋亡損傷的程度可以延長至2小時，但應結合背景染色情況。

7) 樣本清洗不充分。染色后，增加PBS沖洗次數至5次，以避免切片的非特異性染色。

強烈的熒光背景

6.1 不正確的染色程序
1) TUNEL染色時間過長。建議適當調整染色時間，通常在37°C下孵育60分鐘，以避免背景染色。

2) TUNEL染色溶液濃度過高。建議增加稀釋比例以優化濃度。

3) 使用試劑盒中提供的二價陽離子來優化反應。試劑盒中的Mg2+可以減少背景，而Mn2+可以增強染色效率。

4) 用PBS洗滌樣品不足。在TUNEL反應后，將PBS洗滌次數增加到5次，以去除組織切片中殘留的染料。

6.2 不正確的熒光檢測操作
5) 曝光時間過長。首先通過優化負對照組無背景光的曝光條件，然后使用這些曝光條件來捕獲實驗組的圖像（可能需要微調，但不需要大幅度調整）。