腎臟是人體的重要器官之一，負責諸如代謝廢物排除和維持電解質平衡等功能，確保體內環境的穩定。腎臟類器官是腎臟功能的三維模型，有助于模擬人類腎臟疾病。它們主要是從體外的人類多能干細胞（PSCs）誘導而來，并且可以表達各種類似于人類腎單位的結構，包括足細胞、近曲小管、遠曲小管和集合管。

腎臟類器官培養方法

我們根據發表在Nat Protoc.上的一篇文章[1]，編制了從人類多能干細胞培養人類腎臟類器官的方法。

 Figure 1. Process of hPSC Differentiation into Kidney Organoids (PMID: 28005067)[1]

1、人類多能干細胞（hPSC）

培養 hPSCs被接種到涂有不含LDEV的細胞外基質基質的6孔板中，并在含有10 ng/mL FGF2的ReproFF2培養基中培養。健康的未分化hPSCs表現出明確定義的圓形菌落形態，并且它們每七天使用iPSCs的解離溶液傳代一次。

2、人類多能干細胞的分化

當細胞密度達到80%時，使用Accutase解離細胞，重新懸浮在含有10 μM Y27632的ReproFF2培養基中，并接種到涂有不含LDEV的細胞外基質基質的24孔板中。細胞培養3天后，然后更換為Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX、3~10 μM CHIR99021、5-25 ng/mL Noggin、100-500 nM Dorsomorphin）繼續培養，每兩天更換一次培養基，直到細胞形成松散的密集細胞團（通常在96小時內）。隨后，培養基更換為Advanced RPMI 1640（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL Activin A）再培養額外的2-3天。

3、誘導hPSC分化為神經前體細胞（NPCs）

培養基更換為Advanced RPMI 1640（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9）并培養2天。

Figure 2. Morphological changes during hPSC differentiation.

第0天：開始分化的未分化hPSCs（H9）； 第4天：晚期原條階段； 第9天：腎小管前體細胞階段； 第14天：腎囊泡階段； 第21天：腎單位階段； 第4天用Activin A處理的細胞最佳形態特征是松散的密集細胞團。

4. 類器官誘導

4.1 神經前體細胞（NPCs）分化為腎臟類器官（2D）

完成步驟3后，更換為Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9、3 μM CHIR99021），并繼續孵化2天。然后更換為Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9），并培養2-3天。如果觀察到類似腎囊泡的極化結構，帶有腔室，請進行下一步。如果在3天內未觀察到腎囊泡結構，請通過免疫染色確認LHX1的表達。然后更換為Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX），繼續培養，每2-3天更換一次培養基。腎臟類器官在整個分化過程中至少保持3個月的穩定性，并且可以在顯微鏡下識別腎單位結構。

4.2 人類多能干細胞（hPSCs）分化為腎臟類器官（3D）

完成步驟2后，使用Accutase消化細胞，并在Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9、3 μM CHIR99021）中重新懸浮。將細胞接種到超低附著圓底96孔板中，并培養2天。然后更換為Advanced RPMI 1640培養基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9），并繼續培養2-3天，直到在顯微鏡下觀察到類似腎囊泡的球形結構。

Figure 3. Immunostaining of NPC and renal units (PMID: 28005067)[1]

(a) 在分化的第9天，SIX2的免疫熒光染色顯示神經前體細胞（NPC）。比例尺：50 μm； (b) 在2D培養的第21天，通過免疫熒光染色識別分化的腎單位結構。比例尺：50 μm； (c) 在3D培養的第21天，使用冰凍切片識別分化的腎單位結構。比例尺：50 μm； (d) 在3D培養的第28天（左圖，比例尺：50 μm）和第21天（右圖，比例尺：100 μm）的腎單位的免疫染色。PODXL：足細胞標記物，LTL：近曲小管標記物，CDH1：亨氏環和遠曲小管標記物； (e) 3D培養的第21天的類器官的明場圖像，箭頭指示腎小球結構。

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